L.paracasei FX-6产抗菌肽F1对细菌磷脂膜的作用机制及其应用

摘要

抗菌肽的抗菌机制不同于传统抗生素，不易使细菌产生耐药性，可以广泛应用于生物医学、食品保鲜等各个领域。本实验室前期研究中从Lactobacillus paracaseiFX-6的发酵提取物中分离得到抗菌肽F1，具有广谱、高效、稳定的抗菌活性，并对F1的抗菌机理进行了初步探讨。本文在前期研究基础上，进一步深入研究 F1 对细菌磷脂膜的作用机制。通过从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中提取的磷脂、人工合成磷脂制备的脂质体模型以及磷脂双分子层模型研究 F1 对磷脂膜的作用强度和作用类型。并且通过分子动力学模拟，对F1分子在磷脂双分子层上的构型变化、运动趋势以及能量变化等进行详细计算，结合实验数据，对F1的作用方式更进一步的分析。最后将FX-6产抗菌肽提取物应用于荔枝的常温保鲜中，研究抗菌肽的在果蔬防腐中的应用，再通过将FX-6接种到脱脂大豆培养基中发酵，拓展FX-6菌种的应用范围，降低FX-6产抗菌肽的生产成本。具体研究内容如下：　　（1）抗菌肽 F1 对磷脂膜作用强度及机制的研究。F1 能够使对细菌内提取磷脂和人工磷脂所制备的脂质体发生破裂，并且作用强度与磷脂分子的类型有关，对模拟细菌膜磷脂构成的脂质体作用较强，而对模拟动物细胞膜磷脂的脂质体作用很弱，其与F1的强抗菌活性和安全性的特点相关联。通过将磷脂铺展成固体支撑化膜（Solid Supported Lipid Bilayer, SLB），使用耗散型石英晶体微天平（Quartzcrystalmicrobalance with Dissipation, QCM-D）对F1的作用过程进行实时监测，结果表明F1对磷脂膜的作用效果与其浓度有关，低浓度的F1主要表现为吸附作用，而高浓度的F1会导致膜的质量下降，粘弹性增加，磷脂膜破损。　　（2）类似F1肽链（F1-1）与磷脂双分子层作用的分子动力学模拟。在CHARMM力场中通过NAMD（NAnoscale Molecular Dynamics）对F1-1进行分子动力学模拟。本文模拟 F1-1 在缓冲液和两种不同分子构成的磷脂双分子层的体系中发现缓冲液体系中的F1-1运动的自由度较高，肽链的螺旋结构比例会有减少的倾向，而F1-1在磷脂膜表面时会倾向于靠近膜表面，其N端与膜表面相互接触，呈插入姿势，同时RMSD值下降，SASA值上升，且F1-1的肽链中的部分氨基酸与磷脂膜之间形成氢键，同时体系中的范德华能等能量发生显著变化。　　（3）FX-6产抗菌肽粗提物对荔枝贮藏品质的影响。利用抗菌肽粗提物处理采后的荔枝果实，长期贮藏发现FX-6抗菌肽粗提物能够有效抑制荔枝表面的微生物生长，防止果皮霉变，增加好果率，其中1.0 mg/mL的抗菌肽粗提物处理组的果实贮藏至第6天时，好果率仍高于60%，效果优于施保克。同时该粗提物能够在抑制果皮微生物生长的同时，适当降低果皮的pH值，抑制相关酶活，从而有效防止荔枝果皮褐变。因此，表明抗菌肽粗提物有效提高荔枝货架期，改善贮藏品质。　　（4）FX-6菌种的大豆发酵应用。本研究将FX-6接种入脱脂豆浆中进行发酵，发现其发酵物对大肠杆菌等几种常见的食品腐败菌具有很强的抗菌效果，其最佳发酵条件为脱脂大豆浓度80 g/L，添加2%的葡萄糖，初始pH为5，32℃发酵5天。该发酵物中的活性物质含有抗菌肽F1以及抗菌物质F等，且含量比原牛乳发酵物中更高。表明脱脂豆粕可以作为FX-6产抗菌肽的发酵培养基，提高了FX-6产抗菌肽的应用效率。

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