乳清蛋白抗氧化肽的制备及其活性研究

摘要

随着自由基学说的发展和活性氧影响研究的深入，在食品、医药、化妆品和饲料等行业迫切地需要安全、天然、高效的抗氧化产品来替代具有潜在危害的传统合成抗氧化剂，蛋白肽是其中前景十分广阔的一种。乳清蛋白作为优质的蛋白资源，已开发出多种生物活性肽产品。近年来研究发现，乳清蛋白中存在着抗氧化活性序列，然而研究多集中于酶解工艺的优化和初步的纯化过程。本论文通过对乳清蛋白酶解、纯化、测序得到活性肽段，并对产物特性进行研究，以提升乳清蛋白的生理活性和功能特性，扩大乳制品及其副产物应用范围，为抗氧化肽结构特性和作用机理的研究提供借鉴。
　　 本论文首先通过单因素试验，响应面回归分析得到乳清蛋白酶解的最佳工艺为：以胰蛋白酶为酶源，乳清蛋白30 mg/mL、水解时间90 min、温度50℃、酶底物比2％(w/w)、pH7.6。最优酶解条件下，水解度约为19％，10 mg/mL酶解产物的DPPH自由基清除率为78.78％，显示出较好的抗氧化活性。
　　 酶解产物相对分子质量主要集中于185～2632 Da，清除DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子的IC50分别为5.52 mg/mL、6.25 mg/mL、7.16 mg/mL，且具有很高的还原力。酶解产物经肠胃消化酶作用后DPPH自由基清除活性仅下降5％。在pH5～7下具有较高的DPPH自由基清除活性，沸水浴处理30 min仍能保持70％，在冷冻下储藏3个月DPPH自由基清除活性下降约12％。
　　 采用DA201-C大孔吸附树脂，60％乙醇洗脱，对乳清蛋白酶解后产物进行初步纯化，吸附率为78.80％，吸附量为31.16 mg/g，解吸率为96.24％，回收率为75.86％，IC50为4.33 mg/mL。依次采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15、制备型RP-HPLC和分析型RP-HPLC对大孔纯化产物进行分离，最后得到两个肽段A3a和A3b，IC50分别为0.00251mg/mL和0.00495 mg/mL。经Q-TOF MS分析得A3a中母离子m/z1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL，A3b中母离子m/z1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPMEL。
　　 本文研究结果表明，乳清蛋白酶解产物具有良好的耐消化、耐热耐酸碱和耐储藏稳定性，分离纯化得到两个肽段抗氧化活性较好，适宜作为保健食品和食品添加剂。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1抗氧化肽研究进展

1.1.1抗氧化肽的制备

1.1.2抗氧化肽的分离纯化及活性测定

1.1.3乳蛋白抗氧化肽

1.2存在的问题和前景

1.3立题背景和意义

1.4主要研究内容

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验设备

2.3实验方法

2.3.1乳清蛋白酶解工艺

2.3.2蛋白酶活力测定

2.3.3蛋白质水解度测定

2.3.4抗氧化活性测定

2.3.5基本成分测定

2.3.6氨基酸组成测定

2.3.7疏水性值测定

2.3.8色泽分析

2.3.9相对分子质量分布分析

2.3.10大孔树脂初步纯化

2.3.11凝胶色谱分离纯化

2.3.12反相高效液相(RP-HPLC)分离纯化

2.3.13氨基酸序列分析

2.3.14数据统计与分析

3结果与讨论

3.1酶解工艺

3.1.1不同蛋白酶酶解效果比较

3.1.2底物浓度对酶解工艺的影响

3.1.3加酶量对酶解工艺的影响

3.1.4 PH对酶解工艺的影啊

3.1.5温度对酶解工艺的影响

3.1.6酶解工艺的响应面优化

3.2酶解产物特性研究

3.2.1基本成分测定

3.2.2色泽分析

3.2.3氨基酸组成和疏水性值测定

3.2.4相对分子质量分布分析

3.2.5抗氧化活性测定

3.2.6耐消化稳定性测定

3.2.7耐热耐酸碱稳定性测定

3.2.8耐储藏稳定性测定

3.3抗氧化活性肽的分离纯化

3.3.1大孔树脂初步纯化

3.3.2凝胶柱色谱分离纯化

3.3.3制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化

3.3.4分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化

3.3.5各分离纯化产物的相对分子质量分布

3.3.6各分离纯化产物的抗氧化活性和纯化倍数

3.4纯化多肽的序列分析

3.4.1质谱测定多肽序列

3.4.2抗氧化肽的结构分析

主要结论

致 谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文