通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽孢杆菌BS5582β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的研究

摘要

β-1,3-1,4-葡聚糖属植物细胞壁的结构性非淀粉多糖,是以混合(1→3)和(1→4)β-糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物,在大麦整粒和胚乳中含量高达4.0％-8.0％。Β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)能有效水解β-1,3-1,4-葡聚糖,主要产物为三糖(3-O-β-D-纤维二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纤维三糖-D-葡萄糖)。在啤酒工业中,β-葡聚糖酶可降低麦汁粘度,提高麦汁滤速及得率,改善啤酒风味,保持成品酒稳定性。目前市售β-葡聚糖酶多为用于饲料加工的粗酶制剂,酶热稳定性较差。啤酒工业使用复合酶中的β-葡聚糖酶温度稳定性范围也较窄,从而限制了啤酒糖化工艺和啤酒工业的发展。因此,为适应行业发展需要,迫切需要开发耐高温的β-葡聚糖酶,提高我国啤酒产业的国际竞争力。
　　 本研究首先应用基于易错PCR随机突变的体外定向进化技术,来提高淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2.60℃(min)分别比野生酶(18 min)提高4 min,13 min和17 min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min),304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3％,2.6％和10.6％。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76 mg/mL、6.19μmg/mL和6.84 mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,三个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R),2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8％的替代氨基酸是精氨酸,表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。
　　 本研究基于PyMOL软件,将定向进化得到的多株突变体所包含的氨基酸突变,逐一进行单点突变,并借助foldX软件对各个含有单一突变位点的酶蛋白变种逐一进行分子修复和分子自由能(△G)计算,根据分子自由能与热稳定性负相关的关系,七个氨基酸突变中,野生型β-葡聚糖酶第156位由谷氨酸突变为缬氨酸后,酶蛋白分子的自由能由野生型的15.80 kcal/moL下降至14.28 kcal/moL,下降9.6％,在所有突变中下降幅度最大。本研究基于四引物PCR介导的定点突变技术,将野生型β-葡聚糖酶156位的谷氨酸突变为缬氨酸。热稳定性实验结果显示,定点突变体较野生型β-葡聚糖酶分子的半失活温度由52.5℃提高至56.4℃,提高了7.4％。基于SWISS-MODEL数据,对野生型及定点突变体进行蛋白三维结构同源模拟,结果由PROCHECK验证。酶蛋白分子中156位谷氨酸突变为缬氨酸后,由于谷氨酸是亲水性残基,缬氨酸疏水性较强,可能是造成酶蛋白热稳定性提高的主要原因。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 β-葡聚糖

1.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶

1.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源

1.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的结构与性质

1.2.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的应用

1.2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆和表达

1.3 定向进化技术

1.3.1 定向进化技术简介

1.3.2 高通量筛选技术

1.3.3 定向进化技术在生物催化剂改性中的应用

1.4 立题背景和意义

1.5 论文研究思路及研究内容

1.5.1 论文研究思路

1.5.2 论文研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 课题相关培养基

2.1.5 引物序列和测序

2.2 方法

2.2.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达

2.2.2 分子生物学基本操作

2.2.3 主要分析方法

2.2.4 热稳定性提高酶蛋白变种高通量筛选模型的建立

2.2.5 易错PCR技术介导的β-葡聚糖酶热稳定性定向进化

2.2.6 四引物PCR技术介导的β-葡聚糖酶定点突变

第三章 结果与讨论

3.1 热稳定性提高酶蛋白变种高通量筛选模型的建立

3.1.1 IPTG及乳糖对96-微孔板中β-葡聚糖酶表达量的影响

3.1.2 IPTG添加量对96-微孔板中β-葡聚糖酶表达量的影响

3.1.3 乳糖添加量对96-微孔板中β-葡聚糖酶表达量的影响

3.1.4 诱导时间对96-微孔板中β-葡聚糖酶表达量的影响

3.1.5 96-微孔板中β-葡聚糖酶粗酶液热钝化温度的选择

3.1.6 高通量筛选方法的建立

3.1.7 高通量筛选方法的统计学分析

3.2 易错PCR技术介导的β-葡聚糖酶热稳定性定向进化

3.2.1 易错PCR反应条件的优化

3.2.2 突变体文库的构建及突变株的筛选和鉴定

3.2.3 热稳定性提高变体及野生型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分离纯化

3.2.4 野生酶和热稳定性提高突变体的Michaelis-Menten动力学分析

3.2.5 野生酶和热稳定性提高的突变酶的热稳定性测定

3.2.6 热稳定性提高β-葡聚糖酶变体耐热机理分析

3.3 四引物PCR技术介导的β-葡聚糖酶定点突变

3.3.1 基于生物信息学方法的β-葡聚糖酶模拟突变及分子能量计算

3.3.2 突变体的构建与转化

3.3.3 突变体的表达、纯化及热稳定性参数的测定

3.3.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的三维结构同源模拟及突变体耐热机理分析

结论与展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文