黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因克隆表达与定性

摘要

α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20),又名α-D-葡萄糖苷水解酶,可以催化水解低聚糖类生成葡萄糖,其在自然界中广泛分布,性质各异。来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶不仅具有水解活性,还具有转苷能力。当A.nigerα-葡萄糖苷酶作用于麦芽糖时,能够切割开麦芽糖的α-1,4糖苷键,将游离出来的葡萄糖残基以α-1,6形式转移到其他糖底物上,形成具有非发酵性的功能性低聚糖--低聚异麦芽糖(简称IMOs,主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等),因此在工业上广泛应用于IMOs的生产。
　　 本实验室前期的研究工作中,通过重叠PCR扩增得到A.nige SG136的α-葡萄糖苷酶cDNA,并在毕赤酵母(Picha pastoris)中表达,但是所获得的重组酶生化活性较低。本研究以A.niger CICIM F0620的总RNA为模板,通过RT-PCR获得α-葡萄糖苷酶cDNA,并在P.pastoris KM71中表达,同时对重组P.pastoris生产α-葡萄糖苷酶的发酵工艺和重组酶的酶学性质进行研究。主要研究结果如下:
　　 (1)以A,niger CICIM F0620的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到全长为2883bp的α-葡萄糖苷酶cDNA。将该cDNA克隆到P.pastoris表达载体pPIC9K上,BglⅡ酶切线性化后电转入P.pastoris菌株KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选,获得重组菌株:KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶发酵条件下诱导120h,重组菌发酵上清液中的pNPG水解酶活为0.44U/mL。
　　 (2)考察基因工程KM71/pPIC9K-aglu的摇瓶发酵情况,确定适宜的发酵条件为:诱导阶段初始菌浓OD600为50,诱导pH5,诱导温度28℃,每24h添加1.5％(v/v)甲醇,诱导表达周期120h,酶活可达到1.15U/mL,是原始野生菌产酶量的18.2倍。
　　 (3)在3L发酵罐上,通过优化诱导起始菌浓和起始甲醇添加量,KM71/pPIC9K-aglu诱导96h后发酵上清液的pNPG水解酶活达3.51U/mL,蛋白含量为1759μg/mL。其酶活和蛋白含量分别是摇瓶水平的3.0和3.4倍。在30 L罐上进行进一步试验,终酶活达到5.12U/mL,表达量为现有报道中的最高水平。
　　 (4)将重组酵母的发酵上清液经过3 kDa超滤膜浓缩、乙醇沉淀、疏水柱层析后得到纯化的重组α-葡萄糖苷酶。重组α-葡萄糖苷酶在溶液中以二聚体形式存在。SDS-PACE电泳表明,重组酶的分子量为145kDa,经去糖基化酶Endo Hf处理后,分子量减少至115kDa,证明重组酶在P.pastoris表达系统中受到糖基化修饰。重组α-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,在50℃具有良好的热稳定性;最适pH为4.5,pH稳定范围为pH3.0～7.0。在50℃,pH4.5,以pNPG为底物,Km和Vmax分别为0.45mM和43.48U/mg。大多数金属对重组α-葡萄糖苷酶的酶活性无明显影响。
　　 (5)重组α-葡萄糖苷酶具有转苷活性,可转化麦芽糖生成IMOs,转苷能力与市售α-葡萄糖苷酶相近。重组酶的最优转苷条件为:pH5.0的30％(w/v)麦芽糖溶液,加酶量0.05U/g麦芽糖,60℃反应20～24h。在最优反应条件下,IMOs的产量可达183.12g/L,转化率为60％。本研究为重组α-葡萄糖苷酶的工业化大规模生产和在功能性低聚糖生产行业中的应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 A.niger α-葡萄糖苷酶简介

1.1.1 A.niger α-葡萄糖苷酶的性质

1.1.2 A.niger α-葡萄糖苷酶的应用

1.1.3 A.niger α-葡萄糖苷酶的研究进展

1.2 P.pastoris表达系统

1.2.1 P.pastoris表达系统简介

1.2.2 P.pastoris发酵优化策略

1.3 立题依据及意义

1.4 本论文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌种和质粒

2.2 试剂

2.3 主要仪器

2.4 培养方法

2.4.1 培养基

2.4.2 培养方法

2.5 分子生物学操作

2.5.1 A.niger 总RNA的提取

2.5.2 RT-PCR扩增α-葡萄糖苷酶cDNA

2.5.3 PCR产物回收

2.5.4 重组载体构建

2.5.5 化转E.coli感受态细胞

2.5.6 重组质粒的筛选与鉴定

2.5.7 重组P.pastoris的构建与筛选

2.6 分析方法

2.6.1 酵母细胞光密度分析

2.6.2 酵母细胞干重测定

2.6.3 蛋白质含量测定

2.6.4 pNPG水解酶活力测定方法

2.6.5 SDS-PAGE分析

2.6.6 重组α-葡萄糖苷酶的纯化

2.6.7 重组α-葡萄糖苷酶分子量的测定

2.6.8 重组α-葡萄糖苷酶糖基化分析

2.6.9 重组α-葡萄糖苷酶的液相分析

2.6.10 重组α-葡萄糖苷酶的最适温度和热稳定性分析

2.6.11 重组α-葡萄糖苷酶的最适pH和pH稳定性分析

2.6.12 重组α-葡萄糖苷酶的动力学分析

2.6.13 金属离子对重组α-葡萄糖苷酶的影响

2.6.14 重组α-葡萄糖苷酶的转苷反应

2.6.15 HPLC检测转苷产物

第三章 结果与讨论

3.1 A.niger α-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达

3.1.1 A.niger总RNA的提取

3.1.2 α-葡萄糖苷酶cDNA的克隆

3.1.3 重组质粒pPIC9K-aglu的构建与筛选

3.1.4 重组P.pastoris的构建与筛选

3.1.5 重组α-葡萄糖苷酶的表达验证

3.2 重组P.pastoris发酵生产α-葡萄糖苷酶的初步研究

3.2.1 α-葡萄糖苷酶在重组P.pastoris中高效表达的关键因素研究

3.2.2 重组P.pastoris高密度发酵生产α-葡萄糖苷酶的初步研究

3.2.3 30L罐发酵生产重组α-葡萄糖苷酶的研究

3.3 重组α-葡萄糖苷酶酶学性质研究

3.3.1 重组α-葡萄糖苷酶的纯化

3.3.2 重组α-葡萄糖苷酶分子量的测定

3.3.3 重组α-葡萄糖苷酶的液相分析

3.3.4 重组α-葡萄糖苷酶糖基化分析

3.3.5 重组α-葡萄糖苷酶的最适温度及热稳定性

3.3.6 重组α-葡萄糖苷酶的最适pH及pH稳定性

3.3.7 重组α-葡萄糖苷酶的动力学分析

3.3.8 金属离子对重组α-葡萄糖苷酶的影响

4.3 重组α-葡萄糖苷酶制备IMOs的条件研究

4.3.1 重组α-葡萄糖苷酶的转苷能力分析

4.3.2 pH对重组酶转苷反应的影响

4.3.3 温度对重组酶转苷反应的影响

4.3.4 加酶量对重组酶转苷反应的影响

4.3.5 重组α-葡萄糖苷酶转苷能力与市售酶的比较

第四章 结论及展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文