黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因和花生白藜芦醇合酶基因的真核表达

摘要

B-葡萄糖苷酶(B—glucosidase，EC 3.2.1.21，简称bgln)在纤维素的酶水解过程中为最后一步关键酶，不仅能够水解白藜芦醇苷为白藜芦醇，还能够作用于细胞壁碎片等其它细胞组成，从而生成更多的白藜芦醇。 本研究以含有从黑曲霉中获得的编码bgln成熟肽的cDNA的克隆质粒pMD19-bgln为模板，应用PCR技术扩增出2600bp的bgln基因片段，利用真核表达载体pVT102U/a构建pVT102U/a-bgln重组质粒，并通过电穿孔法将其转化到酿酒酵母菌S78中，目标是获得能够高效分泌B-葡糖苷酶的酿酒酵母，将其投入到生产中以提高葡萄酒的风味和经济价值，并进一步探索利用基因工程技术改造微生物以有效利用纤维素的可行性方案，为人类社会的可持续发展做出贡献。结果表明，外源基因在酿酒酵母菌中实现了分泌表达，但是外源蛋白的分子量约100kD较bgln理论值92kD偏大，且没有检测到酶活，这可能和外源蛋白未被正确糖基化有关。 白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素，具有多种医疗保健作用。白藜芦醇合酶(resveratrol synthase，简称RS)是合成白藜芦醇的关键酶。 在课题组成功构建了含花生RS基因的重组毕赤酵母GS115基础上，本研究筛选出能表达外源蛋白的毕赤酵母菌株。诱导表达后取重组酵母的发酵液经SDS．PAGE检测，结果显示：重组酵母发酵液在45kD和100kD附近位置明显增加了两条表达量较高的蛋白带，与RS的理论分子量接近，初步判断可能是外源蛋白；对发酵条件做了初步的优化以提高蛋白的表达，确定其最适发酵条件为：选用BMGY1BMMY培养基、pH值6.0、初始诱导时菌液浓度为OD<,600>=10、诱导时间96h左右、甲醇诱导浓度1％；并对发酵液进行了部分纯化，为下一步酶活的检测乃至利用毕赤酵母大规模生产白藜芦醇合酶打下了良好的基础。

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1研究背景

1.2文献综述

1.2.1白藜芦醇的概述

1.2.2白藜芦醇合酶的概述

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的概述

1.2.4酿酒酵母表达系统

1.2.5毕赤酵母表达系统

1.2.6蛋白质的分离纯化策略

1.3本研究的目的及意义

1.3.1黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中表达

1.3.2花生白藜芦醇合酶基因在毕赤酵母中表达

1.4研究的技术路线

第2章黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中的真核表达

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1 bgln基因的扩增结果

2.3.2 PBS-bgln的酶切检测

2.3.3真核表达载体pVT102U/a-bgln的检测

2.3.4重组真核表达质粒转化酿酒酵母的结果

2.3.5重组酿酒酵母菌株的筛选

2.3.6 bgln基因在酿酒酵母中的发酵表达

2.4小结与讨论

第3章花生白藜芦醇合酶基因在毕赤酵母中的真核表达

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1白藜芦醇合酶基因在毕赤酵母中的表达

3.3.2表达蛋白的分离纯化

3.4小结与讨论

结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历