脂氢过氧化物裂解酶的克隆表达、酶学性质及固定化研究

摘要

脂氢过氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase,HPL)是一种膜结合血红素蛋白,催化脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)的反应产物——脂氢过氧化物(不饱和脂肪酸如亚麻酸、亚油酸的氢过氧化物)裂解生成短链挥发性醛和含氧酸。HPL的催化产物己醛、己烯醛及其醛醇是水果、蔬菜和绿叶特征风味的重要组成成分,作为添加剂,广泛的应用在化妆品工业和食品工业中；在食品工业中,主要用于果蔬加工及储藏过程中的“回鲜”,增加果蔬的商业价值。
　　 根据NCBI中已登录的马铃薯HPL基因设计RT-PCR所需引物。使用Trizol试剂提取马铃薯幼叶中的总RNA,并以此为模板反转录得到cDNA第一链；以该链为模板,PCR扩增获得目的基因并连接到pMD19-T简易载体。测序结果显示,所获得的马铃薯HPL cDNA全长1,443 bp,编码480个氨基酸,编码产物的理论分子量为53.9 kDa。该基因序列已提交到GenBank数据库,登录号为GQ281583。
　　 将该基因插入到表达载体pQE-30中,并转化到宿主细胞E.coli M15中,成功诱导表达出融合了N端His-tag的脂氢过氧化物裂解酶；对重组HPL采用亲和层析法一步分离纯化至电泳纯,分子量约为54 kDa,与理论分子量一致。相比13-亚油酸氢过氧化物(13-HPOD),马铃薯HPL更易催化13-亚麻酸氢过氧化物(13-HPOT),相应的挥发性产物经顶空气相色谱鉴定为正己醛和2-E-己烯醛。重组马铃薯HPL的最适作用pH和温度分别为6.5和25℃；该酶具有较宽的作用pH范围,但对热敏感,高温(40℃以上)下保温易失活；重组马铃薯HPL对13-HPOT、13-HPOD的Km分别为56.6、71.7μM。表面活性剂Triton X-100能够显著提高该酶的酶活,氯化钠、氯化钾同样能提高酶活,而氯化钙、氯化镁不能提高该酶的酶活,氯化钙甚至会降低酶活。
　　 采用海藻酸钠明胶协同包埋、同时使用戊二醛交联制备固定化苋菜脂氢过氧化物裂解酶,考察了海藻酸钠、明胶浓度、CaCl2浓度、交联剂戊二醛浓度及交联时间等因素对固定化脂氢过氧化物裂解酶的影响；比较了固定化酶与游离酶的酶学性质。结果表明,制备固定化脂氢过氧化物裂解酶的最优条件为:海藻酸钠、明胶浓度(w／v)分别为1.25％和0.5％,CaCl2浓度(w／v)为8％,戊二醛浓度(v／v)为1％,交联时间为20 min。固定化酶的最适温度、最适pH较游离酶略有提高；温度稳定性、pH稳定性及贮藏稳定性显著提高。

目录

文摘

英文文摘

1.引言

1.1 脂氢过氧化物裂解酶的研究进展

1.1.1 脂氢过氧化物裂解酶简介

1.1.2 催化机制

1.1.3 酶学性质

1.1.4 二级结构

1.1.5 HPL的亚细胞定位

1.1.6 HPL的分子生物学研究进展

1.1.7 HPL催化产物的生理功能

1.1.8 HPL固定化的研究进展

1.2 本课题的立题依据和意义

1.3 本课题的研究内容

2.实验材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 供试植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 实验主要试剂

2.1.4 主要实验仪器

2.1.5 培养基及试剂配制及灭菌方法

2.2 实验方法

2.2.1 马铃薯叶片中总RNA的提取

2.2.2 引物的设计

2.2.3 RT-PCR

2.2.4 重组质粒 pMD-stHPL的构建

2.2.5 重组质粒pET-C-stHPL及pQE-N-stHPL的构建

2.2.6 基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-C-stHPL及E. coli M15/pQE-N-stHPL的构建

2.2.7 重组脂氢过氧化物裂解酶的诱导表达

2.2.8 重组HPL的分离纯化

2.2.9 重组HPL的活性检测及挥发性产物鉴定

2.2.10重组HPL的酶学性质研究

2.2.11苋菜HPL的固定化

2.2.12苋菜HPL固定化条件的确定

2.2.13固定化苋菜HPL的酶学性质

3.结果与讨论

3.1 马铃薯幼叶中总RNA的提取

3.2 cDNA的RT-PCR扩增

3.3 PCR产物的克隆

3.4 HPL基因测序分析

3.5 基因工程菌的构建

3.5.1 基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-C-stHPL的构建

3.5.2 基因工程菌E. coli M15/pQE-N-stHPL的构建

3.6 基因工程菌的诱导表达

3.7 重组HPL的纯化

3.8 重组HPL活性测定及挥发性产物鉴定

3.9 重组HPL的酶学性质

3.9.1 pH对重组HPL酶活及酶活稳定性的影响

3.9.2 温度对重组HPL酶活及酶活稳定性的影响

3.9.3 Triton X-100对酶活的影响

3.9.4 盐离子对酶活的影响

3.9.5 酶反应动力学常数Km及Vmax

3.10 苋菜HPL固定化条件的确定

3.10.1海藻酸钠和明胶浓度对固定化的影响

3.10.2 CaCl2浓度对固定化的影响

3.10.3戊二醛浓度对固定化的影响

3.10.4戊二醛交联时间对固定化的影响

3.11 固定化苋菜HPL的酶学性质

3.11.1 pH对固定化HPL酶活及酶活稳定性的影响

3.11.2温度对固定化HPL酶活及酶活稳定性的影响

3.11.3固定化HPL的操作稳定性

3.11.4固定化HPL的贮藏稳定性

4.主要结论

致谢

参考文献

附录 : 作者在攻读硕士学位期间发表的论文