水稻种子脂氧合酶-3与稻谷耐储性关系和脂氢过氧化物裂解酶-3生理功能的研究

摘要

粮食的安全储藏是关系国计民生的大问题。据不完全统计，中国每年因稻谷储藏过程中陈化变质、仓储害虫以及霉变影响造成的损失约占总储存量的3%，达数百亿斤，每年损失不低于200亿元。培育耐储型水稻新品种可能是延缓稻谷老化变质的便捷途径。稻谷中的脂氧合酶被认为是导致稻谷中脂肪氧化，加速稻谷劣变的重要因素。然而目前为止，脂氧合酶与稻谷耐储性的关系尚未得到充分阐明。本研究的目的之一是研究稻谷中活性占80～90%的种子脂氧合酶-3(seed lipoxygenase3，sLOX3)对稻谷耐储性的影响及其作用机制，这将为开发sLOX3缺失的耐储藏新品种鉴定理论基础。本研究另一内容围绕一个水稻叶片中起主要作用的脂氢过氧化物裂解酶（HPL负责降解LOX的产物）成员HPL3展开，旨在阐述其在水稻中的生理功能。在研究sLOX3对种子耐储性的影响过程中，与LOX紧密相关脂质氧化终端挥发产物和中间产物过氧化脂质的检测方法得到了摸索，建立了简单有效的分析方法。本研究的主要结果如下：
　　 1、在研究sLOX3与稻谷耐储性关系的过程中改进了稻谷中脂质氧化中间代谢产物（脂质过氧化物）及其降解终端代谢产物（挥发醛醇类物质）的检测方法，并对自然存放和加速老化稻谷中这些物质的积累规律进行了初步探索。
　　 过氧化脂是脂质自然或酶促氧化的直接产物，过氧化脂质含量是检测脂质氧化酸败程度的重要指标。科学研究中对其进行测定的常用方法为亚铁氧化．二甲酚橙显色法（FOX法）。本研究开发了一整套适用于水稻过氧化脂质提取并进行测定的改良FOX2法，并对其溶液配制程序进行了改进。改进的FOX2法解决了标准FOX2溶液测定过氧化脂质时脂肪沉淀的问题，其线性范围在0.1～1.0的读数内。对过氧化脂质提取溶剂进行了摸索，结果显示2:1，1:1和1:2的氯仿:甲醇（乙醇）对过氧化脂质的提取都具有几乎一样良好的效果。在本研究中用1ml氯仿：甲醇(2:1)对不同品种保存不同时间稻谷来源的0.2g稻糠的过氧化脂质进行提取，获得了良好效果，提取和测定程序非常简单快捷，该法完全适用于新鲜及陈化稻谷过氧化物含量的检测，也可用于含油量较高种子过氧化脂质的检测。利用改进的FOX2法对自然或加速老化的稻谷过氧化脂质进行了测定，稻谷中过氧化脂质占总过氧化物的50%以上，稻谷的脂质过氧化物在加速老化(40℃，80%RH)后含量下降，可能与过氧化脂质高温下不稳定有关，而在稻糠过氧化物加速老化后脂质过氧化物含量比稻谷中下降得更快，可能与高温和脂氢过氧化物裂解酶的作用有关；而在自然存放的稻谷中，脂质过氧化物含量随着老化年限（3年内）增加变化较小，且有略微下降的趋势。
　　 脂质过氧化终端产物是一些可挥发的醛醇酮酸类物质，这些物质含量亦是脂质氧化程度的指标。对这些物质的定量检测尚无现成的简便方法。本研究在前人的基础上，开发了固相微萃取技术对稻谷中这些微量的产物进行收集浓缩与气相色谱，质谱对这些物质进行定性定量检测的方法。开发的方法可以一次对所有醛醇类物质进行检测，具有使用样品少(1～2g)、操作简单、省时快捷的优点。本研究还利用开发的方法对存放不同年限的不同品种稻谷中的挥发醛醇进行了检测，发现一些品种陈化后其种子中积累的主要醛醇类物质主要是正戊醛、正戊醇、正己醛和正己醇，而C7-C1O的饱和醛醇类则变化不大，提出把具有良好检测响应的正壬醛与正己醛（或正戊醇或正己醇）在色谱分析中的峰面积比作为稻谷陈化指标的设想，并对这一设想进行了讨论。同时发现，某些品种在储存3年后其醛醇类物质含量基本不变，原因不明。本研究还检测了高温加速老化稻谷中挥发醛醇的积累情况，发现尽管大量的挥发醛醇在加速老化过程中产生，但若敞开方式放置，这些物质绝大部分会挥发至空气中，因而加速老化的稻谷中挥发醛醇含量反比新鲜稻谷低。
　　 本研究的结果提示当以脂质过氧化物和醛醇类物质来衡量稻谷脂质的氧化程度时应该小心，因为即使脂质已经发生较大程度的氧化，由于这两类物质难以积累的特性，它们的含量可能并不大幅增加。还提示加速老化过程中稻谷中脂质氧化产物的积累可能不能真实反映自然老化过程的情形。
　　 2、证明了Os03g0700400是sLOX3蛋白的编码基因，揭示了sLOX3缺失品种中sLOX3缺失的分子机制，对sLOX3的表达、酶活特征和亚细胞位置进行了研究，同时利用转基因材料阐述了sLOX3与稻谷耐储性的关系。
　　 本研究在前人对sLOX3编码基因精细定位的和预测候选基因基础上，对sLOX3突变品种进行了测序，发现一系列sLOX3突变体材料的候选sLOX3编码基因(Os03g0700400)均有相同的突变位点，推测其突变原因为基因第七外显子上一个单碱基突变引起的蛋白质翻译提前终止。分析了Os03g0700400的时空表达，发现其在根中表达最高，其次在胚中，在叶片、茎秆和叶鞘表达极低。对Os03g0700400进行了原核表达，获得了有功能的重组蛋白，其对底物亚油酸和亚麻酸具有几乎等同的催化活性，最适pH范围在5.0～7.0，最适温度在50度左右，该蛋白主要对底物9-位双键进行过氧化，因而是9-LOX，这与前人从水稻种子分离的sLOX3蛋白酶活相似。对Os03g0700400蛋白的亚细胞位置进行了研究，发现其被定位于细胞质中。在sLOX3缺失的水稻品种北陆(PL2)中成功过表达了sLOX3候选基因，PL2种子获得了sLOX3功能正常种子具有的sLOX3特异染色表型，因而证明了Os03g0700400就是前人报道的sLOX3蛋白的编码基因。在sLOX3功能正常的武运粳7号品种中成功过表达了sLOX3。以发芽率的变化为指标比较了人工加速老化(40℃，80%RH)和自然老化（室温及空气湿度）条件下转基因种子与其对照的耐储性差异。结果发现，过表达sLOX3武运粳7号和PL2种子的发芽率在加速老化时比对照种子下降得更快，在自然老化下，过表达sLOX3武运粳7号种子也获得同样的结果。同时也发现，sLOX3对种子的这种负面作用也因品种及植株生长条件不同而呈现差异。进一步研究发现，过表达sLOX3引起的发芽力下降与sLOX3的直接作用——对脂质的氧化似乎没有关系，因为无论自然老化还是加速老化稻谷，过表达sLOX3并不改变脂质氧化挥发产物的积累。有趣的是，放置26个月的武运粳7号稻谷中，过表达sLOX3种子与对照相比，其胚腐烂种子所占比例明显比对照高，而这样一种胚腐烂应该是微生物作用的结果，因此，sLOX3可能促进某些微生物的繁殖，这也可能是导致过表达sLOX3种子发芽力下降的原因。总而言之，sLOX3可以通过降低种子的发芽率和增加种胚腐烂率负面影响稻谷的耐储性。
　　 3、研究了水稻中HPL基因的表达及其挥发酶活产物特征，阐述了HPL3相关代谢产物的生理功能。
　　 通过对HPL基因的表达与其酶催化产物分析发现，HPL3主要在水稻叶片中发挥作用，也是在叶片中起主要作用的HPL成员。HPL3的表达受伤害抑制，是迄今为止第一个被报道受伤害抑制表达的HPL基因成员，这种伤害下的表达模式是LOX途径中包含LOX、丙二烯氧化物合酶（AOS，可能与HPL竞争底物）和HPL在内关键基因协同表达的一部分。HPL3的表达还受茉莉酸甲酯的正向调节，受过氧化氢和乙烯的负向调控。水稻挥发代谢产物（即绿叶挥发物质）主要为正己醛、(E)-2己烯醛和(Z)-3-己烯醇。保留在组织中含量最高组分为(Z)-3-己烯醇，而伤害时释放到空气中的最高组分是(E)-2己烯醛。利用本实验室前人构建的HPL3遗传修饰材料，筛选到了(E)-2己烯醛和(Z)-3-己烯醇降低的株系，发现过表达HPL3反而引起其挥发代谢产物的降低，具体机制尚不明确。利用这些挥发物降低的株系进行功能研究，发现HPL3正义转基因植株中一些抗性基因的表达发生改变，因此HPL代谢产物可以诱导防卫基因表达，外源人工合成的HPL代谢等同物处理验证了这一结论。又发现HPL3过表达材料其种子发芽后初期的生长加快，结合外源等同物处理发现幼苗生长受抑制的结果，得出HPL3代谢产物抑制植物生长的结论，还进一步揭示这种抑制作用与活性氧的积累受到抑制相关。研究还发现HPL3过表达植株的耐冷性下降，揭示了HPL代谢产物与耐冷性相关，这是一项新的发现，揭示了HPL在非生物胁迫中也发挥作用。HPL代谢产物的部分生理功能在本研究中得到了阐述。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1 植物脂氧合酶途径

1．1 植物脂氧合酶途径概述

1．2 脂氧合酶途径的生理功能

1．3 LOX代谢途径的调控

2 稻谷的陈化

2．1 稻谷的结构和主要化学成分

2．2 稻谷的陈化

2．3 脂肪的氧化

3 水稻脂氧合酶／脂氢过氧化物裂解酶与稻谷的耐储性

3．1 水稻中的脂氧合酶家族

3．2 脂氧合酶与水稻种子耐储藏关系的研究历程

3．3 水稻中的脂氢过氧化物裂解酶与耐储藏

4 本研究的目的和意义

第二章 自然储藏及加速老化稻谷中脂质过氧化物和挥发醛醇类物质的积累规律初探

1 材料和方法

1．1 脂质过氧化物的测定

1．2 挥发醛醇类物质的测定

1．3 稻谷材料来源

2 结果

2．1 自然老化稻谷中脂质过氧化物和挥发醛醇类物质的积累规律

2．2 加速老化对稻谷脂质过氧化物及挥发醛醇类物质积累的影响

3 讨论

第三章 水稻种子LOX3基因在稻谷老化中的作用研究

1 材料和方法

1．1 sLOX3突变体材料候选sLOX3 DNA序列的测序

1．2 RNA提取

1．3 定量RT-PCR

1．4 sLOX3基因的原核表达

1．5 sLOX3基因原核表达蛋白的酶活分析

1．6 过表达sLOX3转基因水稻的获得

1．7 I2-KI方法检测sLOX3酶活

1．8 原生质体制备和激光共聚焦分析

1．9 分光光度计法检测种子sLOX3酶活

1．10 种子来源

1．11 加速老化种子发芽率测定

1．12 GC-MS测定挥发性脂质降解挥发醛醇类物质

1．13 基因组DNA的提取——SDS提取法

1．14 常规分子生物学方法

2 结果

2．1 sLOX3缺失品种与正常品种sLOX3候选编码基因DNA序列的差异

2．2 sLOX3候选基因的时空表达

2．3 sLOX3候选基因重组蛋白的酶学特征

2．4 sLOX3蛋白的亚细胞定位

2．5 在水稻中过表达sLOX3基因

2．6 sLOX3与稻谷耐储性关系研究

3 讨论

3．1 Os03g0700400是sLOX3的编码基因

3．2 水稻sLOX3与其他LOX蛋白的比较

3．3 水稻sLOX3可能在根中发挥重要功能

3．4 sLOX3催化的脂质氧化在稻谷总脂质氧化中可能占很小比例

3．5 sLOX3可能促进某些病原菌侵染种子

4 结语

第四章 水稻脂氧合酶途径中一个脂氢过氧化物裂解酶的功能研究

1 材料和方法

1．1 植物材料的种植

1．2 伤害和激素处理

1．3 (E)-2-己烯醛处理水稻植株

1．4 基因组DNA提取——SDS法

1．5 转基因材料DNA水平的检测

1．6 RNA提取

1．7 定量RT-PCR

1．8 绿叶挥发物质的提取和GC-MS分析

1．9 用人工合成HPL挥发代谢产物等同物对水稻幼苗进行处理

1．10 转基因与野生型幼苗发芽后生长比较试验

1．11 苗期低温耐受性检测

1．12 HPL酶提取和酶活测定

1．13 过氧化脂质提取和测定

1．14 JA测定

1．15 研究所用引物信息

2 结果与讨论

2．1 水稻中HPL基因的时空表达

2．2 水稻叶片中OsHPL3的表达在伤害处理前期受到抑制

2．3 OsHPL3的表达受伤害信号分子调控

2．4 水稻叶片中HPL挥发产物的特征

2．5 在水稻中过表达OsHPL3基因引起HPL代谢产物含量下降

2．6 HPL代谢产物调节防卫基因表达

2．7 HPL代谢产物抑制水稻幼苗生长

2．8 OsHPL3代谢产物的积累降低导致水稻植株耐冷性下降

3 结语

参考文献

全文结论

主要创新点

附录一 LOX途径中的反应

附录二 改良FOX2法以检测稻谷过氧化脂质含量

附录三 用改良HS-SPME-GC-MS法对稻谷挥发性物质进行定性定量检测

附录四 自然存放或加速老化稻谷中过氧化物的积累规律

附录五 加速老化稻糠中过氧化物的积累

附录六 sLOX3功能研究相关附件

附录七 植物HPL蛋白的系统进化分析

附录八 HPL转基因植株的检测

致谢

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