miR-195在前列腺癌转移中的作用及其表达调控机制

摘要

本文分为两个部分进行探讨：
　　第一部分 miR-195在前列腺癌转移及上皮间质转化中的作用
　　目的:研究miR-195在转移前列腺癌及非转移前列腺癌之间表达的差异，miR-195表达在转移前列腺癌的诊断以及前列腺癌术后生化复发中的作用。明确miR-195在前列腺癌转移及上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition，EMT)中的作用及机制，为前列腺癌转移的机制提供理论基础和试验依据。
　　方法:对Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC)数据库中获得的关于前列腺癌miRNA表达的基因芯片数据进行二次分析，比较其在转移及非转移前列腺癌中的表达差异。分析miR-195在转移前列腺癌诊断作用及其与非转移前列腺癌生化复发的关系。通过原位杂交检测miR-195在转移及非转移前列腺癌中的表达。通过Transwell迁移和侵袭实验明确miR-195对前列腺癌细胞转移的作用，通过Western bloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化，明确miR-195对上皮间质转化的调控作用。通过荧光素酶报告基因及Western bloting证实碱性成纤维因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF/FGF2)是miR-195的靶基因。然后通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制FGF2的表达，Transwell迁移和侵袭实验检测低表达FGF2对前列腺癌细胞转移的影响，Western bloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化。在高表达miR-195的细胞中应用人重组FGF2后，Transwell迁移和侵袭实验检测前列腺癌细胞转移能力，Westernbloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化。最后通过免疫组化检测转移及非转移前列腺癌组织中FGF2的表达。
　　结果:对MSKCC数据库资料的二次分析表明，miR-195在转移前列腺癌中的表达低于非转移前列腺癌。接受者操作特性曲线(Receiver-operating characteristiccurve，ROC)分析表明miR-195能够用于转移前列腺癌的诊断，其曲线下面积(Area under the curve，AUC)为0.705，95％置信区间为0.507-0.903，P=0.017。原位杂交显示，miR-195在转移前列腺癌组织中的表达低于非转移前列腺癌组织。在前列腺癌细胞中高表达miR-195能够抑制细胞的迁移和侵袭能力，同时上皮间质转化常见标识蛋白波形蛋白(vimentin)和N-钙粘素(N-cadherin)水平降低，E-钙粘素(E-cadherin)水平升高。报告基因及Western bloting结果表明FGF2为miR-195的直接靶基因。通过siRNA抑制FGF2的表达后，前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力下降，波形蛋白和N-钙粘素水平降低，E-钙粘素水平升高。而在高表达miR-195的前列腺癌细胞中应用人重组FGF2处理后，前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显恢复，应用人重组FGF2也使波形蛋白和N-钙粘素水平升高，E-钙粘素水平降低。免疫组化显示，FGF2在转移前列腺癌组织中的表达高于非转移前列腺癌组织。
　　结论:miR-195在转移前列腺癌患者组织中的表达低于非转移患者，miR-195能够用于转移前列腺癌的诊断。体外实验证明，miR-195能够通过FGF2抑制前列腺癌细胞的上皮间质转化，降低前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力。
　　第二部分 NF-κB1调控miR-195的表达
　　目的:明确核因子κB1(Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer inB-cells1，NF-κB1)能够抑制前列腺癌中miR-195的表达。
　　方法:通过生物信息学数据库JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）预测可能调控miR-195表达的转录因子。通过实时定量PCR（real time quantitative PCR）筛选抑制miR-195表达的转录因子。接着通过荧光素酶报告基因及电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)证实转录因子NF-κB1与miR-195启动子区的直接结合。在前列腺癌细胞中应用siRNA技术抑制NF-κB1的表达，实时定量PCR观察miR-195的表达。最后通过原位杂交检测前列腺癌组织中miR-195的表达，免疫组化检测NF-κB1的表达，并分析两者之间表达的相关性。
　　结果:通过JASPAR数据库预测，我们猜想血清效应因子(serum response factor,SRF)、早期生长反应因子1（early growth response1，EGR1）、Sp1转录因子(Sp1transcription factor,SP1)、NF-κB1、KLF5（Kruppel-like factor5）、叉头框蛋白P1（forkhead box P1，FOXP1）、Fli-1原癌基因（Fli-1 proto-oncogene，FLI1）可能调控miR-195的表达。实时定量PCR表明，SP1、EGR1、KLF5、FOXP1、FLI1高表达后miR-195在PC-3细胞中的表达量增高，而高表达NF-κB1、SRF后PC-3细胞中miR-195表达量降低。在起抑制作用的转录因子中NF-κB1的转录抑制作用最大。荧光素酶报告基因和EMSA实验证实前列腺癌中存在NF-κB1与miR-195启动子区的结合。而在前列腺癌细胞中通过siRNA抑制NF-κB1表达后miR-195表达升高。原位杂交和免疫组化的结果表明，NF-κB1的表达与miR-195的表达呈负相关。
　　结论:NF-κB1在前列腺癌中抑制miR-195的表达。

目录

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摘要

缩略词

前言

中文综述 miRNA在前列腺癌上皮间质转化中的作用

第一部分 miR-195在前列腺癌转移及上皮间质转化中的作用

1．材料与方法

2．统计学分析

3．实验结果

4．讨论

5．结论

第二部分 NF-κB1调控miR-195的表达

1．材料与方法

2．统计分析

3．实验结果

4．讨论

5．结论

致谢

参考文献

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