猪A组轮状病毒VP6基因转植物的研究

摘要

猪轮状病毒病(Porcine rotavims disease)是由轮状病毒(Rotavirus，RV)引起的仔猪急性胃肠道传染病。其临床症状为：发烧、呕吐、恶心、腹泻、严重时可导致幼畜脱水，成年猪一般呈隐性感染。除感染猪外，还可感染人及牛、羊等动物。轮状病毒病发病日龄小、发病急以及死亡率高。没有特异性药物，只能以预防为主。在我国，猪轮状病毒分布广泛，给畜牧业造成巨大的经济损失。因此，对猪轮状病毒进行有效的防治是降低仔猪发病率，提高养猪业效益的有效手段。1992年Mason提出“转基因植物疫苗”利用分子生物学技术把外源基因导入到植物细胞中，在植物中能够大量表达外源基因的一种生物技术。 VP6蛋白是轮状病毒第六个基因编码的内壳蛋白，而且也是主要的结构蛋白，约占病毒蛋白的50％。其具有较高的免疫原性和抗原性，它在检测病毒粒子的诊断方法中是最主要地靶蛋白。虽然抗VP6抗体没有中和抗体反应，可是Esquivel FR et al报道VP6蛋白能增强中和抗体应答反应。随后Feng N et al研究人员认为中和抗体反应的水平并不是总与保护关联。由VP6蛋白产生的非中和IgA单克隆抗体在活体内起到免疫作用，以抵抗轮状病毒的感染，而不是轮状病毒特异的血清IgG。 依据上述思路，根据VP6基因序列和原核表达载体pET5a序列，合成了一对特异性引物RO1/RO2，分别引入限制性酶切位点NdeⅠ和BamHI。以RO1/RO2为引物，以pGEM-T-Easy-VP6为模板，经PCR扩增得到1.194kb的VP6基因片段。以BamHI和NdeⅠ双酶切VP6基因片段，与经同样双酶切的pET5a原核表达载体线性分子相连接，转化到EColi BL21(DE<,3>)Plyss中，然后经IPTG诱导表达，结果表明已成功表达了VP6蛋白，而且获得了大小为44KD的蛋白。 然后再根据VP6基因序列和植物表达载体pBI121序列，合成了一对特异性引物RO3/RO4，分别引入限制性酶切位点BamHI和SacⅠ。以RO3/RO4为引物，以pGEM-T-Easy-VF6为模板，经PCR扩增得到1.194kb的VP6基因片段。以BamHI和SacⅠ双酶切VP6基因片段，与经同样双酶切的pBI121植物表达载体线性分子相连接，转化到E.coli DH5a中，然后经卡那抗性筛选的阳性菌落送去测序，最后结果表明已成功的构建了植物表达载体pBI121-VP6。 以冻融法将pBI121-VP6重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404，用叶盘法转化于NC89烟草和保定紫花苜蓿的无菌试管苗。经过愈伤诱导、分化培养基的培养，最后分化出再生苗，并经过卡那霉素(Kan)抗性筛选，获得了80株转基因NC89烟草的卡那抗性再生植株；可是没有保定紫花苜蓿转基因苗。经卡那抗性筛选的转基因烟草再生苗，提取植物总DNA和RNA，分别经过PCR、RT-PCR扩增，然后以PCR-Southern，Dot-blotting杂交检测，这些结果表明VP6基因已经成功的整合到转基因Nc89烟草染色体上并正确的转录。 经检测为阳性的转基因再生苗，提取植物蛋白，经Wrestern-blotting检测，已经成功的表达了VP6蛋白而且表达的蛋白具有反应活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第一章绪论

1.1轮状病毒的概况

1.2轮状病毒蛋白的结构与功能

1.3轮状病毒流行病学

1.4国内外轮状病毒转基因植物的研究现状

1.5植物转化系统研究进展

1.6本论文研究的目的和意义

第二章技术路线

第三章VP6基因的原核表达

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1引物设计

3.2.2大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞的制备

3.2.3碱裂解法少量提取pGEM-T-Easy-VP6重组质粒DNA

3.2.4 pGEM-T-Easy-VP6酶切鉴定反应体系(20ul)

3.2.5 VP6的PCR扩增反应体系(100ul)

3.2.6 CTAB法回收酶切VP6和pET-5a的DNA

3.2.7 VP6与pET5a连接反应体系(10ul)

3.2.8大肠杆菌的转化

3.2.9重组质粒酶切鉴定

3.2.10VP6基因的表达

3.3实验结果

3.3.1重组质粒pGEM-T-Easy-VP6酶切

3.3.2 VP6基因PCR扩增

3.3.3重组表达质粒pET5a-VP6酶切

3.3.4 SDS-PAGE电泳分析

3.3.5 pET5a原核表达载体的构建

3.4讨论

3.5小结

第四章植物表达载体的构建

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1引物设计

4.2.2VP6的PCR扩增反应体系(100ul)

4.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备

4.2.4CTAB法分别回收VP6和pBI121载体的DNA片段

4.2.5VP6与pBI121连接反应体系(15ul)

4.2.6重组质粒转化

4.2.7酶切鉴定

4.2.8测序

4.3实验结果

4.3.1 VP6基因PCR扩增

4.3.2重组表达质粒pBI121-VP6 DNA酶切

4.3.3序列分析

4.3.4植物表达载体pBI121的构建

4.4讨论

4.5小结

第五章NC89烟草、保定苜蓿的转化与卡那霉素抗性苗筛选

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1无菌试管苗扩繁

5.2.2根癌农杆菌转化NC89烟草和紫花苜蓿

5.2.3农杆菌的活化

5.2.4NC89烟草的转化

5.2.5紫花苜蓿的转化

5.3结果

5.3.1农杆菌转化

5.3.2烟草转化

5.3.3紫花苜蓿的转化

5.3.4植物转化模式图

5.4讨论

5.5小结

第六章转基因烟草的检测

6.1实验材料

6.2实验方法

6.2.1转基因植株PCR鉴定

6.2.2转基因植株RT-PCR鉴定

6.2.3转基因烟草PCR-Southern杂交检测

6.2.4转基因烟草的DNA点杂交鉴定

6.2.5转基因烟草蛋白的Western-blotting检测

6.3实验结果

6.3.1植物总DNA

6.3.2转基因烟草的VP6的PCR扩增

6.3.3植物总RNA

6.3.4转基因烟草的VP6的RT-PCR扩增

6.3.5DIG标记探针的检测

6.3.6转基因烟草的PCR-Southern杂交检测

6.3.7转基因烟草的Dot-blotting杂交

6.3.8转基因烟草的Western-blotting检测

6.4讨论

6.5小结

第七章讨论

第八章结论

参考文献

致谢

作者简介