猪A组轮状病毒Vp6基因工程乳酸菌的制备及其免疫效果检测

摘要

该项研究分为两个阶段：乳酸菌基因工程疫苗实验室研究阶段和免疫实验动物检测阶段。回收纯化得到猪A组轮状病毒 Vp6 基因以及质粒载体pW425et。将纯化的Vp6基因亚克隆至双标记载体 pW425et中，构建出可以在大肠杆菌和乳酸杆菌中穿梭表达的原核表达重组质粒 pW425et-Vp6。将构建的重组质粒转化入thyA基因缺陷型的大肠杆菌E.coli X13中，SDS-PAGE检测，可见约48kD的融合蛋白。Western blotting分析，表明蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性，重组质粒转化入乳酸杆菌中，SDS-PAGE检测，可见约48kD的融合蛋白。Western blot分析，表明该蛋白同样具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。转化入重组质粒的嗜酸性乳酸杆菌即为免疫用基因工程乳酸菌。 将购自吉林大学基础部实验动物中心的3-4周龄BALB/c小鼠分成4组，每组20只，分别是A组：空对照组；B组：普通嗜酸性乳酸杆菌组；C组：重组基因工程大肠杆菌组；4组：重组基因工程乳酸杆菌组。小鼠购进之日起，每日定时、定量饲喂溶于脱脂牛奶中的乳酸菌。在第0、14、28、42天取小鼠粪便表层，通过间接ELISA检测肠道特异性抗体SIgA，间接ELISA检测血清中的特异性抗体。以及对CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴细胞相对数量检测和CD<'+>19B淋巴细胞相对数量的检测。 免疫后机体在免疫水平上的变化如下：体液免疫水平显著提高，表现在血清中抗轮状病毒特异性IgA的含量明显上升，CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>、CD3<'+>/CD4<'+>、CD3<'+>/CD8<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>T淋巴细胞相对数量的变化也反应出机体良好的免疫状态。研究证明机体已经通过该疫苗的免疫具备了预防轮状病毒感染的能力。局部免疫方面，刺激肠道上皮组织中的固有层细胞分泌出了大量的 SIgA，使轮状病毒最容易侵害的胃肠道出现了一种有效对抗感染的免疫环境。SIgA的含量明显提高，是抵御轮状病毒感染最重要的免疫指标的体现。 本项研究在检测该疫苗能否有效防治幼畜轮状病毒性腹泻的同时，还探索了乳酸菌在预防动物疾病中作为基因工程菌株的潜在作用，尤其是安全性方面的作用。为进一步研制更加安全、方便、低成本的新型轮状病毒疫苗打下良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语

声明

第一部分前言

1轮状病毒概述

2轮状病毒的生物学性状

3 RV的分子生物学特性

4轮状病毒的病原性

5预防及RV疫苗研究现状

6轮状病毒新疫苗前景

7本研究的目的及意义

第二部分实验研究

实验一猪A组轮状病毒Vp6基因与双标记表达载体pW425et的重组及在大肠杆菌中的表达

1.材料与方法

2结果

3讨论

实验二基因工程乳酸菌pW425et-Vp6的制备

1材料和方法

2结果

3讨论

实验三基因工程乳酸菌免疫效果的检测

1材料和方法

2结果

3讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历