来源于抗-VP6骆驼科动物抗体的单体VHH结构域、二聚体结构域、免疫方法、轮状病毒检测方法、组合物、用于轮状病毒感染的预防和治疗方法

摘要

来源于抗-VP6骆驼科动物抗体的单体VHH结构域、二聚体结构域、免疫方法、轮状病毒检测方法、疫苗组合物、用于轮状病毒感染的预防和治疗方法，其中所述结构域可以是SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的任一种氨基酸序列，且其中所述结构域结合A组轮状病毒的蛋白VP6。

说明书

本发明涉及来源于抗-VP6骆驼科动物抗体的单体VHH结构域、二聚体结构域、免疫方法、轮状病毒检测方法、组合物、用于轮状病毒感染的预防和治疗方法。更具体地，本发明涉及来源于骆驼科动物抗体的单体结构域(VHH)，其中所述结构域可以是SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4中所示的任一种氨基酸序列，且其中所述结构域结合A组轮状病毒的蛋白VP6。

发明背景

A组轮状病毒(RV)是在儿童和许多有经济学利益的动物物种(牛、猪马、南美洲骆驼等等)的幼崽中严重腹泻的主要原因。作为公共健康问题，在发展中国家中，RV是第三大最常见的与严重腹泻有关的死亡的原因(每年200万例死亡)。在另一个方面，在意欲用于消费的动物如小牛中的RV-引起的腹泻导致与预防或治疗相关的高成本。

A组RV是由三联蛋白衣壳组成的颗粒。外衣壳表面由蛋白VP4和VP7组成，该两种蛋白是高度可变的抗原；迄今为止，至少已经记述了27种VP4(P-型)变体和16种VP7(G-型)变体。每种G-P型组合诱导与其他G-P型具有低交叉反应性的中和抗体；因为该原因，在疫苗中需要包括在目标物种中循环的不同毒株。

中间衣壳由三聚体蛋白VP6组成，其代表51％的病毒体质量。取决于在蛋白VP6中存在或不存在两种不同的表位(由单克隆抗体mAb255/60和631/9识别)，A组RV毒株另外分类为I，II，I+II和非I非II亚组(Sb)。人RV通常为Sb II，而动物RV主要为Sb I。蛋白VP6是高度免疫原性的；天然感染的人和动物发展针对VP6表位的强体液应答。不论上述亚组，VP6是所有A组RV中高度保守的蛋白(＞90％的氨基酸同一性)，并且共享的共有抗原可以通过广泛反应性多克隆抗血清或单克隆抗体检测。因此，VP6是大部分设计用来检测A组RV的免疫诊断测试中的靶抗原。针对该蛋白的抗体在体外不具有中和活性。然而，在小鼠中，IgA单克隆抗体设法阻断病毒在细胞内复制。

目前，预防动物中RV-引起的腹泻基于被动免疫，而在人类中使用主动免疫。在动物中，将在肠胃外灭活的病毒疫苗应用于妊娠的雌兽，以通过由初乳和乳汁传递母体抗体而保护新生动物。该策略在防止严重腹泻症状和减少感染的家畜的发病率(morbility)和死亡率方面是高度有效的，但是这不能预防RV传染，因为这不显著减少由感染的动物分泌的病毒数量(Parreno，V.C.等，Vet Immunol Immunopathol(兽医免疫学和免疫病理学)100：7-24，2004)。只有在肠腔内持续存在高滴度的被动抗-RV抗体(天然产生的或人工添加到乳汁中的)完全防止腹泻，且显著减少病毒分泌(Fernandez，F.M.等，Vaccine(疫苗)16：507-16，1998；Saif，L.J.等，InfectImmun(传染免疫学)41：1118-31，1983，和Saif，L.J.等，Adv Exp Med Biol(实验医学和生物学进展)216B：1815-23，987)。

在儿童中，已经批准了两种通过遗传复性(reassociation)减毒的活病毒疫苗。已经证明两种产品针对严重RV-引起的腹泻的良好功效。然而，鉴于与先前人类中所用的疫苗相关的内填历史(Murphy，T.V.等，J InfectDis(传染病杂志)187：1309-13，2003)和最近在天然感染的儿童中发现RV病毒血症(Ray，P.等，J Infect Dis(传染病杂志)194：588-93，2006，和Blutt，S.E.等，Lancet362：1445-9，2003)，所述疫苗的无害性已经引起怀疑，特别是在早熟的(premature)、免疫抑制的和营养不良的儿童中。因此，对于RV-引起的腹泻的预防和治疗需要备选的补充策略。

被动免疫策略，如哺乳，施用由牛初乳或蛋类纯化的抗-RV抗体(人和牛抗-RV IgG和鸡蛋蛋黄IgY)显示出减少人和动物中的腹泻疾病。但是以低成本方式且具有可重现的特性生产大量抗体的可能性很低。因此，需要生产设计用于动物和人类中的被动抗-RV免疫的抗体，特别是可以以工业规模生产的抗体，所述抗体不引起免疫学反应，所述抗体充分小足以有效到达保守的内在蛋白的表位，且所述抗体能够识别和抑制来自不同基因型的毒株的复制(多反应性的)。

骆驼科动物抗体重链的VHH结构域，具有15kDa的重量，是具有完全的抗原-结合能力的最小的已知天然结构域，其对于产生关于具有天然抗原识别能力的单链片段的编码DNA文库是理想的。此外，免疫美洲驼(llamas)的策略可以用来使VHH文库富含针对目的抗原的那些。由于其特别的特性，来源于美洲驼抗体重链的VHH结构域是用于开发诊断试剂和设计用于预防或治疗RV-引起的腹泻的产品的非常通用的工具。例如，在酵母中产生的针对G3G-型RV毒株的VHH，最近已经报道在体外表现出中和活性，且纯化的VHH能够减少泌乳小鼠中的RV-引起的腹泻的发生和持续时间(Pant，N.等，J Infect Dis(传染病杂志)194：1580-8，2006，和van der Vaart J.M.等，Vaccine(疫苗)，5月8日，24(19)：4130-7，2006)。然而，这些作者尚不能鉴定获得的VHH针对何种病毒蛋白，且他们假定它们可能针对外在蛋白的构象表位。

专利文献WO 2006/056306公开了VHH结构域或其片段的生产和作为关于由致肠病微生物如RV产生的传染病的治疗的应用。其表明了所述VHH的生产或其在特定位点释放系统中的应用。例如，其公开了特定的VHH在胃肠系统中通过包封在藻酸盐中的释放。此外，作为一种释放方法，其提议使用转基因益生菌(probiotic)微生物，其释放特定的VHH抗体且其中所述微生物可以在人肠道中集群。其提议使用由益生菌微生物包封或表达的VHH抗体制备药物或食品的不同方法。所生产的VHH不与VP6结合，应该不是中和性的，且还不被自身利用，但是在受控释放系统内。

Muyldermans Serge的专利文献US 20050054001，公开重链抗体，重链抗体的功能结构域，功能VH结构域或其片段，其包括特定修饰的或突变的氨基酸序列的。其没有公开与结合RV VP6的VHH结构域相对应的序列。

专利文献WO 00/65057公开了包括单可变结构域的单价蛋白，其结合病毒抗原，特别是乳球菌属(Lactococcus)的噬菌体P2。其仅公开了抑制所述噬菌体的VHH序列。

Hamers等的专利文献US 2007/0009512，以及相同发明人的早先的文献公开了免疫球蛋白的重链片段及其用于兽医用治疗如被动免疫治疗或血清治疗的应用。所述的VHH仅是被破伤风毒素。用来获得所述VHH的方法来自免疫的骆驼科动物的mRNA。

发明简述

本发明的一个目的是提供来源于骆驼科动物抗体的单体结构域(VHH)，其中所述结构域可以是SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的一个氨基酸序列，且其中所述结构域结合A组RV的蛋白VP6。

本发明的另一个目的是提供结合A组RV的蛋白VP6的二聚体结构域，其中所述融合蛋白包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的至少一个单体序列。在优选实施方案中，所述融合蛋白包括SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12中所示的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供轮状病毒免疫检测法，其包括使包含RV的样品与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9中所示的一个氨基酸序列或它们的组合相接触；和显色。

所述免疫检测法可以通过本领域已知的任何技术进行，例如：基于免疫捕获的检测ELISA，ELISPOT，竞争性ELISA，磁珠或pen-side。

本发明的另一个目的是提供赋予哺乳动物被动免疫性的组合物，其包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8或SEQ ID No.9中所示的任何序列，赋形剂和免疫调节剂。

本发明的另一个目的是提供针对由RV产生的感染的预防方法，其包括给需要其的哺乳动物施用有效量的SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12或其组合中所示的任何序列，其中所述序列是单独的或与包封且保护它们免于在胃肠道被降解的物质组合。

本发明的另一个目的是提供关于由RV产生的感染的治疗方法，其中所述方法包括给需要其的哺乳动物施用有效量的SEQ ID No.1，SEQ IDNo.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ IDNo.11，SEQ ID No.12或其组合中所示的任何序列，所述序列是单独的或与包封且保护所述抗体免于在胃肠道被降解的物质组合。

附图描述

图1.美洲驼免疫。免疫时间表，免疫时间过程中的样品收集、最终采血和血清中轮状病毒抗体反应的评估：抗体滴度通过下列各项测量：(i)使用重组VP6的ELISA，(ii)使用轮状病毒(IND；Sb IP[5]G6)的ELISA，(iii)病毒中和和(iv)使用相同轮状病毒(IND；Sb IP[5]G6)的ELISPOT。接种时间点用箭头表示。

图2.通过蛋白质印迹分析检测天然的和重组的VP6蛋白。BRV IND(A)或重组VP6(B)在还原条件下；或非还原条件下运行，且用下列各项检测：泳道1和8-牛多克隆血清抗-A组RV；2和9-抗VP6 Mab(RG25A10)；3和10-VHH 2KA4抗VP6；4和11-VHH 2KD1抗VP6；5和12-VHH 3B2抗VP6；6-和13 VHH 3A6抗VP6；7和14-不相关的VHH。

图3.VHH-ELISA：用来自不同动物物种的不同亚组反应性和G/P型特征检测轮状病毒毒株。

A)抗体-捕获的单体VHH 2KA4，2KD1，3A6(2μg/孔)。

B)用二价VHH biv2KA4，biv2KD1，biv3A6(1μg/孔)直接包被。牛轮状病毒IND(SbI；P[5]G6)，C486(SbI；P[1]G6)和B223(SbI；P[11]G10)；人轮状病毒Wa(SbII；P[8]G1)和马轮状病毒H2(Sb非I，非II；P[12]G3)的组织培养物上清；阳性粪便：与用牛轮状病毒IND试验感染的小牛的病毒释放峰值相对应的粪便样品；MA-104：假感染细胞的上清。PBS：(反应空白)，阴性粪便：对于轮状病毒是阴性的小牛粪便样品。

误差柱表示两次独立测量的标准偏差。

图4.体外轮状病毒荧光病灶减少测定。将每种单价VHH 2KA4，2KD1，3A6和3B2的4倍稀释物与相同体积的包含100FFU的轮状病毒混合。认为引起感染率减少＞80％的VHH浓度是具有保护性的。

A.牛轮状病毒C486(与用于接种和小鼠攻击的Ag同源)；

B.牛轮状病毒IND(与用于结合剂选择的Ag同源)；

C.牛轮状病毒B223；

D.人轮状病毒Wa；

E.马轮状病毒H2。

该图表示两次独立的测定的概括结果。

图5.在用轮状病毒攻击的新生小鼠中通过单价VHH 2KA4，2KD1，3A6和3B2获得的针对腹泻的保护率。从第0天至第5天，幼崽用100μg(100μl)的每种VHH喂养，每天一次，通过胃内途径。在第1天，在常规喂食后2小时，用RV胃内攻击幼崽。每天追踪腹泻情况，直到攻击后96小时。

A.攻击：30DD50(6x105FFU)牛轮状病毒C486。实验在每组5只小鼠的三次独立测定中进行。

B.攻击：316DD50鼠轮状病毒ECw。实验在每组5只小鼠的两次独立的测定中进行。

C.通过ELISA定量在10％w/v小肠匀浆中的病毒释放。

符号#意指与未处理/攻击的组显著不同的感染动物的百分数，Fisher精确检验，p＜0.05。

柱表示每组在405nm处ELISA吸光度的平均值。误差柱表示±标准偏差。ELISA截断值：0.200。

图6A.显示VHH在粉纹夜蛾(T.ni)幼虫中的表达。表达水平足够高，足以在考马斯染色中检测出两条预测分子量的条带。B.显示在幼虫系统中表达的VHH的量化。

图7显示使用来自幼虫的VHH的ELISA技术。将来自表达VP6的幼虫[Ag(+)]或由感染了非-插入型重组杆状病毒(baculovirus)的幼虫[Ag(-)]的总可溶蛋白(TSP)提取物用来包被ELISA微量滴定平板(Polysorp，Nunc，丹麦)，以在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6中40μg/孔开始连续稀释，且在4℃温育过夜(O.N)。

发明详述

为了本申请的目的，术语“结构域”是可以不依赖于蛋白链的其余部分而进化、行使功能和存在的一部分蛋白(抗体)序列和结构。每个结构域形成紧凑的三维结构域，且通常可以独立地稳定和折叠。许多蛋白由数个结构性结构域组成。一个结构域可能在多个进化相关的蛋白中出现。结构域在长度上从约25个氨基酸到至多500个氨基酸长度之间变化。结构域能够结合表位。本申请的结构域结合A组RV的蛋白VP6。

为了本申请的目的，术语“VHH”，“VHH结构域”，“单体VHH”和“VHH单体”被认为具有相同的含义且可以互换。

为了本申请的目的，术语“蛋白VP6”，“抗原VP6”和“VP6”被认为具有相同的含义且可以互换。

为了本申请的目的，术语“二聚体结构域”，“VHH二聚体”和“二聚体VHH”被认为具有相同的含义且可以互换。

术语“同源二聚体”定义为由两个相同的单体结构域，通过或不通过连接序列形成的蛋白或多肽。

术语“异源二聚体”定义为由两个不同的单体结构域、通过或不通过连接序列形成的蛋白或多肽。

表述“适当的生长条件”是指为了提高转基因细胞(由本发明定义的载体转化的、转染的或感染的)的生长而建立的适当的环境。例如，将感染的幼虫保持在28℃的生长室内，且在指定的时间进行收集。

为了本发明的目的，“疫苗”是一种用于引入针对特定疾病的免疫性的制剂。设计用于赋予哺乳动物被动免疫性的组合物，其特征在于，其包括选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，和它们的组合形成的组的氨基酸序列；赋形剂和免疫调节剂。

表述施用给哺乳动物以预防由RV产生的感染的“有效量的氨基酸序列(多肽)”，是指预先估算的结合最终将感染宿主生物体的病原体(病毒)的表位并阻断其作用所需要的氨基酸序列(多肽)的量。

表述施用给哺乳动物用于治疗由RV产生的感染的“有效量的氨基酸序列(多肽)”，是指结合表位和阻断已经感染宿主生物体的病原体的作用所需要的氨基酸序列(多肽)的量。

为了本发明的目的，术语“哺乳动物”一般是指哺乳动物(Mammalia)纲的成员，例如：人、牛、山羊、绵羊、猪和马。

连接序列定义为连接两个单体结构域的氨基酸序列。

记述了针对A组RV的中间衣壳蛋白VP6的VHH抗体的选择、获得和表征。表明本发明的VHH是广泛反应性蛋白，其可以操作以用于检测A组RV的通用免疫诊断测定中。此外，表明一些所选择的抗-VP6VHH在体外具有广泛的中和活性，且一些所述VHH在体内保护免遭病毒攻击。基于他们的了解，本发明人相信本发明的VHH是最先记述的结合蛋白VP6且具有中和活性的分子。

为了获得本发明的VHH结构域，进行图1所示的动物免疫时间表。为了评估美洲驼的免疫反应，抗-RV和抗-VP6抗体滴度通过ELISA、病毒中和(VN)测定分析，且在外周血中的循环的特异性抗体-分泌细胞通过ELISPOT分析。如预料的，在接种后(DPI)第0天，美洲驼对抗-RV抗体是阳性的，表明先前与该抗原接触过。然而，没有抗体-分泌细胞在血液中循环。在注射后第7天，由ELISA确定的抗-IND-RV或抗-VP6抗体滴度较高，且在外周血中检测到RV-特异性抗体-分泌细胞的峰值(16个产生抗-RV IgG的细胞/5x10⁵个单核细胞)。从注射后第14天体液反应达到稳定水平，其具有高的针对全病毒和蛋白VP6的抗体滴度。相反，对于所研究的所有不同RV(IND，B223，Wa和H2)，中和抗体滴度保持近似且非常低。尽管在血清中获得非常高的抗体滴度，但是在血液中检测到的抗-RV抗体分泌细胞的量随着每次加强而减少(图1)。因为这一原因，且为了提供足够的时间以有助于抗体亲和成熟，美洲驼直到很晚以后，即注射后第246天(约在第4次给药后7个月)才接受最后的VP6给药。最后，美洲驼在最后加强后4天时采血，达到26.8个抗-RV IgG分泌细胞/5x10⁵个单核细胞的数值。自900ml血液中提取6x10⁸个单核细胞(依据ELISPOT结果，其包含至少32,160个RV-特异性IgG抗体-分泌细胞)。由处理的RNA(210μg)，产生包含6x10⁷个克隆的VHH噬菌体文库。所用的接种方案显示，为了获得本发明的VHH，更重要的是获得高的特异性抗体-分泌细胞的数值而不是高的针对目的抗原的抗体滴度。在所用的接种方案中，获得充足数量的特异性抗体-分泌细胞是可能的。在免疫过程中获得的结果允许我们突出强调，追踪免疫的美洲驼的免疫反应以建立VHH文库的最佳方法是选择评估外周血中循环的特异性抗体-分泌细胞的数量而不是针对目的抗原的血清抗体滴度的技术。根据所获得的抗体-分泌细胞的模式，表明在最后两次给药之间具有长的时间间隔的接种方案促进更多数量的特异性抗体-分泌细胞在外周血中循环。还表明，在接种后4天时，比在接种后7天时，存在更多数量的针对目的抗原的循环抗体-分泌细胞。接种方案应该以这样的方式进行，以致在最后一次给药后至少5个月时对美洲驼施用加强剂量，且当在外周血中达到约20个抗-靶抗原IgG抗体-分泌细胞的数量时，产生噬菌体集落。优选地，对于抗-VP6VHH，外周血中IgG抗体-分泌细胞的数量必须是约30个抗-完整-rt IgG抗体-分泌细胞。本领域的那些技术人员明白其他的免疫方案可以用来获得对本发明的方法和组合物合适的VHH。

为了选择表达抗-RV VHH的噬菌体，在体外使用RV IND作为抗原进行三轮选择。选择了192个克隆。限制性分析对于所有在VHH文库中表现出大VP6-结合多样性的克隆进行；这是通过噬菌体ELISA确定的。所述克隆还通过ELISA分析以确定它们结合RV和VP6的能力。从具有不同序列的14个克隆中，选择10个表现出较强的针对RV和VP6的特异性结合的克隆，且将它们亚克隆在提供羧基端六组氨酸标记物的表达载体中，以促进其纯化(表1)。

表1

选择VHH结构域的定量评估的结果的总结

¹使用抗-组氨酸抗体与平板结合。

选择了4个与对应于不同亚组的RV毒株更强结合的克隆；这些克隆称为2KA4(SEQ ID No.1)，2KD1(SEQ ID No.2)，3A6(SEQ ID No.3)和3B2(SEQ ID No.4)，由蛋白质印迹评估，其识别重组VP6及其天然副本RV IND，这表明所述VHH结合该蛋白VP6的构象表位(图2)。在下文中，称为2KA4，2KD1，3A6和3B2的VHH为本发明的VHH结构域。

编码每一VHH结构域的DNA序列如下：

SEQ ID No.5编码SEQ ID No.1结构域；

SEQ ID No.6编码SEQ ID No.2结构域；

SEQ ID No.7编码SEQ ID No.3结构域；

SEQ ID No.8编码SEQ ID No.4结构域；

本领域的那些技术人员已知编码所述结构域的任何DNA序列在本发明的范围之内。例如，氨基酸序列SEQ ID No.1可以由DNA序列SEQ IDNo.5或由因为遗传密码的简并而与SEQ ID No.5不同的另一DNA序列编码。相同的举例对于由各自的DNA序列(SEQ ID No.6，7和8)编码的每一氨基酸序列(SEQ ID No.2，3和4)是正确的。

本发明的抗-VP6特异性VHH作为用于RV免疫诊断的试剂是非常有效的。本发明的VHH的单体形式在ELISA中作为捕获抗体、作为二抗或利用抗-His抗体固定而测定。本发明的VHH能够检测具有不同特异性亚组和不同的G与P型的人或动物来源的RV毒株(图3A)。

另一方面，构建表达载体来产生特异性结合VP6的本发明的二聚体VHH，这构成与同人IgA铰链序列相似的连接序列结合的相同VHH基因。本发明的二聚体VHH还在ELISA中作为直接的捕获进行评估，其对于所研究的所有RV毒株表现出清楚的、可重现的信号(图3B)。本发明的二聚体VHH可以用于ELISA平板致敏，由此消除对使用VHH捕获抗体的需要，且显示出比它们的单体副本更好的RV检测结果。

值得强调的是，在大肠杆菌(E.coli)周质(periplasma)中表达的单体VHH的产量与由其他作者在大肠杆菌和酵母中报道的那些相当。

已证明本发明的单体和二聚体VHH对于RV的诊断是非常有效的，且因此，可以在本领域技术人员已知的任何免疫诊断中用作重组单克隆抗体。对于本领域技术人员明显的是，本发明的单体和二聚体VHH结构域可以用于检测RV的任何类型的免疫诊断测定，且所述测定落在本发明的范围之内。

本发明的抗-VP6结构域可以用来构建二聚体如本文所述的那些，例如，同源二聚体，或可以融合形成异源二聚体，例如，通过融合结构域3B2和结构域3A6，或融合任意两个本发明的VHH单体。此外，三个或更多本发明的VHH单体也可以融合或组合产生同源三聚体或异源三聚体。由本发明的VHH单体的组合产生的所有多聚体形式，不管它们是否包含连接序列，均落在本发明的范围之内。在一个优选的实施方案中，本发明的VHH二聚体具有SEQ ID No.9，或SEQ ID No.10，或SEQ ID No.11，或SEQ ID No.12公开的序列。例如，所述二聚体可以包括氨基酸连接序列，如SEQ ID No.13中所示的序列，或作用为铰链序列的任何其他序列。

下述表格显示本发明的二聚体和单体VHH的一些特征。

表2

特征

¹由针对RV IND和重组VP6的WB确定

²基于一组6份培养物，其每份0.5l，利用抗-组氨酸标记柱来纯化。

³检测RV毒株Sb I，Sb II，Sb非I；非II。

本发明的抗-VP6VHH结构域能够在体外中和不同的RV毒株。4个本发明的单体中的3个(2KD1，3A6和3B2)在体外表现出广泛的中和活性。每种VHH的中和能力对于评估的所有RV毒株是相似的。由3.9μg/ml开始的单体浓度能够在体外完全中和由100FFU RV毒株C486(P[1]G6)，IND(P[5]G6)，B223(P[11]G10)，Wa P[8]G1和H2(P[12]G3)产生的传染性。

表3列出了具有关于每种单体2mg/ml的浓度的溶液针对不同RV毒株的中和滴度。

表3

不同的单体和二聚体VHH结构域的中和滴度

¹关于不同RV毒株的中和抗体滴度，表示为减少＞80％的每100FFU的每种RV毒株产生的病灶形成单位的最高VHH稀释的倒数。

因此，所述VHH单体能够中和属于通常不诱导交叉中和作用的不同G/P型组合的RV毒株。具有最高中和能力的VHH单体是单体2KD1。另一方面，尽管单体2KA4在ELISA中能够适当地识别所有RV，但是它不中和任何所研究的毒株。本发明的VHH中和高滴度的抗原性不同RV毒株的能力是非常显著的，且使得它们成为多中和性分子；这种特性使得它们成为用于RV引起的腹泻的潜在的预防或治疗工具，而与血清型无关(27种P-型和16种G-型)。

二聚体VHH表现出比它们的单体副本低的中和活性。

评估了本发明的VHH单体治疗和预防由RV感染产生的腹泻的能力。为了这一目的，给新生小鼠施用每日胃内剂量的VHH，持续5天(第0天到第4天)。在第1天，用病毒株C486攻击小鼠，同样通过胃内途径(图5)。60％用本发明的单体VHH 3B2处理的小鼠受到保护免于遭受RV引起的腹泻。当在处理的小鼠和未处理的小鼠或用不相关的VHH处理的那些之间进行比较时，该种保护作用显著更大(p＝0.0108)，其中所有的小鼠患有腹泻(表4和图5)。此外，与对照组相比较，在用本发明的VHH处理的动物中的腹泻的严重性和持续时间显著降低。

表4

在泌乳小鼠中针对轮状病毒攻击的保护作用

na：不适用

具有不同字母的同一栏的平均值显著不同(Kruskal Wallis，p＜0.05)。

具有不同字母的感染动物的百分数显著不同(Fisher精确检验，p＜0.05)。

值得注意的是，最高中和滴度针对人异源RV毒株(Wa，SbII，P[8]G1)获得，认为所述毒株是世界范围内与儿童肠胃炎最常相关的毒株。

这些抗体片段的生产和纯化可以以高产率进行，导致较低的生产成本。这在发展中国家特别有重大意义，在发展中国家中，感染量级和由RV引起的发病率(morbility)/死亡率是巨大的，且治疗和预防成本是关键的局限性因素。

本领域的任何技术人员明白，基于本文公开的内容，本发明的VHH结构域可以通过合成相对应的核苷酸序列且在任何宿主细胞中对其进行表达而生产，无需产生噬菌体文库。

本领域的任何技术人员清楚的是，本发明的VHH单体、VHH二聚体或VHH多聚体的不同组合和混合物可以用于RV感染的免疫诊断、预防和对RV感染的哺乳动物的治疗，而不改变本发明的精神，且其中所有可能的组合和混合物均落在本发明的范围之内。

正如前文已经提及的，选择了4种与对应于不同亚组的RV毒株更强结合的克隆。这些克隆称为2KA4(SEQ ID NO：1)，2KD1(SEQ ID NO：2)，3A6(SEQ ID NO：3)和3B2(SEQ ID NO：4)，通过蛋白质印迹评估时，其识别重组VP6及其天然副本RV IND，这表明所述VHH结合该蛋白VP6的线性表位。

本发明的所述结构域(SEQ ID NO：1-4)或编码它们的核苷酸序列(SEQ ID NO：5-8)可以插入到适当的重组载体，诸如表达载体中。因此，本发明还涉及包括所述序列的表达载体。所述载体的选择是将要向其中引入所述载体的宿主细胞类型的函数。举例来说，所述载体可以是这样的质粒或载体，其一旦被引入到宿主细胞中，就整合或不在所述宿主细胞的基因组中。所述载体可以通过利用本领域技术中包括的任何已知的方法[Sambrok等1989]获得。在优选实施方案中，本发明的载体可以用来插入到植物或动物细胞的基因组中。因此，本发明的载体可以是，例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或能够在植物或动物细胞中表达的病毒载体。在特定的实施方案中，用于本发明的病毒载体是杆状病毒(Baculovirus)(见实施例5)。

所述载体可以用于转化、转染或感染植物、藻类或动物细胞，优选昆虫或幼虫细胞。因此，本发明还涉及由本发明的载体转化、转染或感染的细胞。

在本发明的优选实施方案中，转基因细胞是动物细胞，优选是昆虫细胞，且更优选是所述昆虫的幼虫的细胞。因此，本发明还涉及转基因非人动物，诸如转基因昆虫或转基因幼虫，其以高产率表达由SEQ ID：1-4表征的肽。

因此，本发明的载体可以用来生产和/或保存由SEQ ID NO：1-4和/或9-12表征的本发明的结构域。因此，本发明还涉及生产本发明的结构域的方法，其包括在允许产生所述结构域的条件下生长用本发明的载体转染、转化或感染的细胞或生物体。用于最优化转基因细胞或生物体的培养物的条件将取决于所用的细胞或生物体的类型。如果需要的话，用于生产本发明的结构域的方法还包括按照本领域已知的任何方法对它们的分离和纯化。

在优选实施方案中，本发明涉及特征在于包括任何本发明的结构域的抗体：

·来源于骆驼科动物抗体的单体VHH结构域，其特征在于其包括选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4形成的组的序列，其中所述结构域结合A组轮状病毒(RV)的蛋白VP6。

·结合A组RV的蛋白VP6的二聚体VHH结构域，其特征在于其包括选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的序列形成的组的至少一个单体序列。

本发明的另一个方面涉及用于免疫检测RV的试剂盒，其包括选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，以及它们的组合形成组的氨基酸序列。

本发明还涉及选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，以及它们的组合形成的组的氨基酸序列，其用于预防由RV产生的感染的方法。换言之，本发明涉及选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，以及它们的组合形成的组的氨基酸序列用于制备用于预防由RV产生的感染的组合物的应用。

此外，本发明还涉及选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，以及它们的组合形成的组的氨基酸序列，其用于治疗由RV产生的感染的方法。换言之，本发明涉及选自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12，以及它们的组合形成的组的氨基酸序列用于制备用于治疗由RV产生的感染的组合物的应用。

最后，本发明涉及用于被动免疫的方法，其包括在人或动物体内接种有效量的上文定义的抗体。

按照布达佩斯条约的微生物保藏

质粒pFBMelVHH(见实施例5)于02.07.08日期保藏在西班牙典型培养物收藏中心(Spanish Type Culture Collection)(CECT)；瓦伦西亚大学(University of Valencia)，西班牙，保藏号为CECT7431。

实施例

本发明通过下述实施例最好地示例，其不应该解释为对其范围施加的限制。相反，必须清楚地明白，可以使用本说明书在不背离本发明精神和/或本发明范围的条件下可能向本领域技术人员提示的其他实施方案、修改及其等价物。

实施例1：本发明的单体和二聚体VHH的获得和纯化

本发明的VHH文库的获得

在选择VHH的生物淘选过程中使用参照牛IND RV毒株(SbI；P[5]G6)作为抗原。为了具有代表不同亚组与来自不同动物物种和来自人类的G和P型的不同组合的反应性的RV组，在进行的不同测定中包括表4中列出的参照RV毒株来产生VHH。病毒在猴肾细胞(MA-104)中繁殖。还包括来自在预接种和在病毒扩散峰值的时刻感染IND毒株的缺乏初乳的新生小牛的粪便样品。

表5

在生产和表征本发明的VHH的过程中进行的不同方法中使用的参照轮状病毒毒株

美洲驼的免疫：来源于牛RV毒株的蛋白VP6

C486(SbIP[1]G6)，在用重组杆状病毒感染的Sf9细胞中产生。一岁龄的雄性美洲驼在第0，21，28，35和246天时接受5次包含与INTA油佐剂(Marcol:Arcel:Span:吐温)混合的500μgVP6的粗细胞提取物的给药。在每次接种后的第0，4和7天采集血清和血液样品。通过ELISA和病毒中和(VN)(进一步参见下文)评估体液反应。为了评估效应B细胞反应，调整ELISPOT测定，其基于先前在猪和小牛中进行的ELISPOT测定(Parreno，V.C.等，Vet Immunol Immunopathol(兽医免疫学和免疫病理学)100：7-24，2004，和Parreno，V.V.等，J Vet Med B Infect Dis Vet PublicHealth(兽医医学杂志B传染病和兽医公共卫生)48：713-20，2001，结合于此仅作为参考)，确定接种的美洲驼外周血中的RV-特异性抗体-分泌细胞的数目。简言之，在96-孔平板中生长的感染了BRV IND(通过免疫荧光检测具有超过80％的感染)的MA-104细胞使用70％丙酮固定，空气干燥且保存在-20℃直到对它们进行使用。将来源于接种的美洲驼的外周血(PB)的单核细胞(MNC)悬浮液添加到孔中(1x10⁶；5x10⁵；2,5x10⁵和1,25x10⁵个细胞/孔)。在以500g离心5分钟后，将平板在37℃在5％CO₂中温育12-14小时。将平板用含有0.05％吐温-20的PBS洗涤，以去除黏附的细胞，且通过在37℃加入以1/1,500稀释的在ELISA中使用的相同缀合物2小时，及随后通过50μl TMB过氧化物酶底物系统(KLP，马里兰，美国)来形成点印迹(spots)。

依据由INTA’s动物福利道德委员会核准的流程，由经过训练的人员在兽医的监督下进行美洲驼样品的处理、接种和收集。

VHH文库的产生和本发明的VP6-结合VHH的选择：由在最后注射后4天收集的总共900ml血液中，通过Ficoll Paque梯度离心提取6x10⁸个单核细胞；然后，将它们离心，冷冻在液氮中，并随后保存在-80℃。使用RNA提取设备(Macherey Nagel；Nucleospin RNA II)提取总RNA，获得250μgRNA。随后，利用Superscript III反转录酶设备(Invitrogen)，使用OligodT(12-18)引物(Invitrogen)或随机引物(Invitrogen)，合成第一cDNA链。在20-μl的反应混合物中，使用0.2，1或5μg的总RNA。使用引物CALL01(SEQ ID No.14)和CALL02(SEQ ID No.15)，通过PCR特异性扩增编码VHH和VH的cDNA，所述引物与前导序列和CH2序列退火。在与900-pb的片段(外显子VH-CH1-CH2)分离后，从1.6％琼脂糖凝胶洗脱600-pb的片段(外显子VHH-CH2，无外显子CH1)。然后，使用在构架区1(SEQ ID No.16)和构架区4(SEQ ID No.17)退火的引物，和使用包含用于随后的克隆步骤的限制性位点的引物：VHHfor2：(SEQ ID No.18)，其具有关于NcoI和PstI的限制性位点，和VHHrev2(SEQ ID No.19)，其具有关于NotI的限制性位点，通过另外的嵌套式PCR扩增VHH。使用上游限制性位点NcoI或PstI和下游限制性位点NotI，将最终PCR片段连接在噬菌粒载体pAO-Lib中，pAO-Lib是pHEN4的修饰形式(ArbabiGhahroudi M，Desmyter A，Wyns L，Hamers R，Muyldermans S.Selectionand identification of single domain antibody fragments from camelheavy-chain antibodies(来自骆驼重链抗体的单结构域抗体片段的选择和鉴定).FEBS Lett.1997年9月15日；414(3)：521-6)，其包含在插入VHH后去除的不相关的长序列，以这样的方式来延迟不具有VHH插入物的载体的潜在的增殖。用所连接的材料转化大肠杆菌(TG1)细胞，且接种细胞。从平板上刮下菌落，在增补了甘油(50％终浓度)的LB培养基中洗涤且保存在-80℃。

使用噬菌体展示技术由所述文库选择特异性VHH。将VHH文库用M13辅助噬菌体(Invitrogen)感染，且拯救并用PEG沉淀表达VHH全体的噬菌体颗粒，如Marks，J.D.，Hoogenboom，H.R.，Bonnert，T.P.，McCafferty，J.，Griffiths，A.D.，Winter，G.JMB，1991所述。特异性VHH的富集通过两至三轮体外选择进行，即，通过称为生物淘选的技术进行。免疫管在4℃用半纯化的BRV IND(SbI；P[5]G6)的1/50稀释物或用来自豚鼠的抗-RV多克隆抗血清在pH 9.6的碳酸缓冲液中的1/5,000稀释物包被过夜，然后是封闭步骤，且捕获相同的BRV IND的1/50稀释物。拯救的噬菌体用BRV IND温育，这是直接进行的或具有这样的步骤，即先前捕获的，洗涤，和结合的噬菌体颗粒用100mM pH 10.0的三乙胺洗脱，且立即用pH 7.4的Tris中和。洗脱的噬菌体用来感染指数生长的TG1细胞。在第二或第三轮生物淘选后，生长单个克隆，且通过噬菌体ELISA分析相对应的VHH克隆。

本发明的单体和二聚体VHH的表达和纯化：将在ELISA中为阳性的克隆的VHH cDNA用限制性酶NcoI和NotI重新克隆在表达载体pHEN6中(Conrath，K.E.M.等.Antimicrob Agents Chemother(抗菌剂化学治疗)45：2807-12，2001，结合于此仅作为参考)，所述表达载体提供周质的pelB靶向序列和羧基端六-组氨酸标记物。使用引物Bivfor2(SEQ ID No.20)和Bivrev2(SEQ ID No.21)(SEQ ID No.22)，通过VHH序列的PCR扩增来构建二价VHH，所述引物编码与人IgA铰链相关的连接体。将PCR产物和包含VHH模板的pHEN6载体用NcoI和PstI消化，且连接以产生载体pAO-biv，其包含所述二价VHH。为了产生单价或二价VHH，用不同的质粒构建体转化大肠杆菌XL1 Blue细胞。在27℃用1mM异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)诱导VHH表达16小时(Sambrook，J.，和Russell，D.W.，2001，Molecular Cloning(分子克隆))。在离心细胞后，通过渗透压休克提取周质蛋白。使用N-High-TrapHP螯合柱(Amersham Biosciences(安马西亚生物科学))从所述周质提取物中纯化VHH。

实施例2：本发明的VHH的表征

蛋白质印迹：将在杆状病毒系统中表达的VP6浓缩物，和BRV IND浓缩物重悬在Laemmli样品缓冲液中，煮沸10分钟。然后将它们通过12％SDS-PAGE柱运行，且转移到Immobilon P膜上(Millipore，Berdford，MA)。该膜用包含10％脱脂奶的PBS/吐温(0.05％)封闭45分钟，并且将每种VHH(4μg/ml)在环境温度下温育2小时。然后，将膜用PBS/吐温(0.05％)洗涤，且用抗-五组氨酸抗体(在PBS/吐温(0.05％)BSA(3％)中的1/500稀释物)在4℃温育过夜。最后，将它们用HRP-缀合的山羊抗-小鼠IgG(1/5,000稀释物)(Amersham(安马西亚)，Pharmacia，Biotech(生物技术))在环境温度下温育40分钟。测定用ECL(Amersham Biosciences(安马西亚生物科学))显色。

本发明的VHH的测序：为了测序VHH，使用“M13正向”和“M13反向”寡核苷酸，按照这一方法进行：Big Die终止子循环测序快速反应试剂盒(Big Die Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(AppliedBiosystem(应用生物系统))，在ABI-Prism 377 DNA自动测序仪(PerkinElmer，Applied Biosystems(应用生物系统))中进行。

实施例3：使用本发明的VHH的RV免疫检测测定

酶免疫测定(ELISA)和蛋白质印迹：通过直接用RV致敏或通过用在限菌猪中产生的多克隆抗体捕获RV或重组VP6，在Maxisorp 96-孔平板(Nunc)中进行ELISA实验。作为用于阴性对照的抗原，使用假感染的MA-104细胞和在杆状病毒中表达的不相关的蛋白(牛腹泻病毒的蛋白E2)。使用PBS作为空白，且使用未免疫的豚鼠血清作为阴性捕获。

按照Parreno，V.C.等，Vet Immunol Immunopathol(兽医免疫学和免疫病理学)100：7-24，2004所述分析美洲驼血清中抗-RV抗体的存在，且使用由Fernández等(Fernandez，F.M.等，Vaccine(疫苗)16：507-16，1998)修改的方法分析抗-VP6抗体的存在。美洲驼IgG使用1/2,000稀释的过氧化物酶-标记的山羊抗-美洲驼IgG(H+L)(Bethyl，lab inc，Montgomery，CA，USA)检测。

通过噬菌体ELISA分析来源于由生物淘选获得的单个克隆的噬菌体。简言之，将在载体phen4中包含不同VHH基因的单个指数生长的大肠杆菌TG1克隆用M13辅助噬菌体感染，以产生表达与表面蛋白融合的VHH的噬菌体颗粒，并且在用BRV IND或VP6致敏的ELISA平板中测定包含噬菌体后代的培养物上清。结合的噬菌体使用HRP-缀合的抗-M13p8抗体(Amersham(安马西亚)，Pharmacia，Biotech(生物技术))的1/5,000稀释物在环境温度下进行检测40分钟。测定使用H₂O₂/ABTS(Zymed)进行显色。

首先，将用羧基端6-His标记物纯化的单价或二价VHH作为用于通过ELISA检测RV或VP6的试剂来研究，如上文所述，所述ELISA通过抗-五组氨酸单克隆抗体(Qiagen，1/5,000)和HRP-缀合的山羊抗-小鼠抗体进行显色。其次，将这些作为RV捕获剂进行分析，均通过10μg/ml VHH的直接ELISA平板致敏和通过10μg/ml抗-组氨酸单克隆抗体，且随后是20μg/ml VHH捕获。该测定使用RV多克隆抗血清来显色，所述RV多克隆抗血清来自用BRV IND(1/2,000稀释物)和1/5,000稀释的过氧化物酶-标记的抗-牛IgG(H+L)(KPL，Gaitherburg，马里兰，美国)超免疫的缺乏初乳的小牛。

二聚体VHH作为处于10μg/ml的RV捕获剂通过ELISA检测。

单体VHH还作为二抗进行测定，且ELISA使用抗-五组氨酸单克隆抗体和HRP-缀合的山羊抗-小鼠抗体(1∶1,000稀释物)(Amersham(安马西亚)，Pharmacia，Biotech(生物技术))进行显色。

病毒中和测定：关于病毒IND，C486，B223，Wa和H2在美洲驼血清样品和纯化的VHH中的中和抗体滴度通过荧光病灶中和(FFN)确定，如在To，T.L.等(J Gen Virol(遗传病毒学杂志)79(Pt 11)：2661-72，1998)中所述。简言之，将100μl连续稀释的美洲驼血清，选择纯化的VHH单体或二聚体与等病毒体积混合，以获得100个病灶形成单位(FFU)/100μl混合物，且在37℃温育1小时。将100μl的抗体-病毒混合物涂布在MA-104单层(4个重复)上，且在37℃温育48小时。平板用70％丙酮固定，且测定使用来自用RV超免疫的缺乏初乳的小牛的FITC-标记的抗-RV抗体进行显色(developed)。VN滴度表示为导致＞80％的荧光病灶数目减少的样品中的最高稀释的倒数。

实施例4：本发明的单体和二聚体VHH用于预防和/或治疗哺乳动物的应用

在新生小鼠中的RV保护测定：

从第0天开始，每天一次，持续5天，使用胃内探针，将100μg在100μl中的每种抗-VP6 VHH单体施用给4日龄的Balb/c小鼠。在第1天，常规VHH给药后2小时，泌乳的小鼠用100μl包含2x10⁶FFU/ml的BRVC486(SbI；P[1]G6)攻击，并然后使用20μl 5％碳酸氢盐溶液攻击，同样通过胃内途径。接种能够在100％的未处理的对照小鼠中引起腹泻。实验中所用的对照组为：(i)用RV接种且未用抗体处理的小鼠；ii)用相同量的不相关VHH处理的小鼠，所述不相关VHH针对细胞蛋白；iii)用450μg来源于豚鼠多克隆抗血清、针对同源RV的VN滴度为2048的亲和纯化的IgG处理的小鼠；iv)用相同量的来自血清反应阴性对照豚鼠的IgG处理的小鼠；v)未感染和处理的小鼠。在5天的研究过程中，临床上通过直接触诊小鼠腹部而评估RV引起的腹泻。腹泻的严重性通过基于粪便的颜色和硬度指定数值，按每日进行分析，如VanCot t，J.L.等，J Virol(病毒学杂志)80：4949-61，2006所述。使用Fisher精确检测来比较各组之间患有腹泻的小鼠的比例。使用Kruskal Wallis无参数检测来比较处理组之间的腹泻的平均发作、持续时间和严重性。

实施例5：重组杆状病毒生成

重组杆状病毒BacMelVHH由包含VHH 3B2完整序列的phen 6质粒产生。使用下述引物：SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，由phen 6质粒PCR扩增蛋白。然后利用包含在相对应的引物中的BamHI和XbaI限制性位点，将扩增子与来源于蜜蜂蜂毒肽(melitin)的昆虫信号序列一起框内克隆到pFastMelB2载体中。得到的pFBMelVHH质粒通过自动化测序表征，且用来利用Bac-to-杆状病毒系统(Invitrogen，USA)按照供应商的使用说明产生重组杆状病毒BacMelVHH。在sf21昆虫细胞中繁殖和扩增重组的杆状病毒，以达到107-109pfu/ml的感染滴度，且将储液保存在4℃用于日常应用，和保存在-80℃用于长期储存。

昆虫生长条件和接种

对于表达实验，使用已知的pfu/幼虫剂量，对重约250mg的第五龄期幼虫(在蛹化前的最后龄期的幼虫)在腹足附近(体腔前)注射重组杆状病毒。将感染的幼虫保持在28℃的生长室内，且在指定的时间进行收集。然后，立即冷冻幼虫，且在处理之前保持在-20℃。

还使用已知的剂量感染昆虫细胞培养物。将感染的细胞在28℃保持72小时。最后，收获感染的培养物，且同样将细胞沉淀立即冷冻，且在处理之前保持在-20℃。

制备蛋白提取物

通过将冷冻的幼虫混合于在PBS 1X中包含triton 0,01％、DTT 25mM和蛋白抑制剂混合物(完全，Roche(罗氏)，德国)的提取缓冲液中来获得来自粉纹夜蛾幼虫的总可溶蛋白(TSP)。

分析蛋白提取物

进行考马斯蓝染色和免疫印迹分析，从而量化和检测包含在TSPs中的特异性VHH蛋白。因此，将20μg TSP/泳道上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。在电泳后，凝胶用考马斯蓝溶液染色，或转移到硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell，)上，以进行蛋白质印迹。

对于蛋白质印迹测定，将SDS-PAGE(12％)转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad，USA)上。膜用PBS-0.05％吐温20(PBST)4％脱脂奶(封闭缓冲液，BF)在4℃封闭过夜，并且然后在室温(RT)用兔抗-VHH血清(在BF中1∶100)温育1小时。膜用PBST洗涤3次，且最后加入抗-兔IgG-HRP-标记的缀合物(在BF中1∶2000，Sigma(西格玛)，美国)1小时作为二抗。在用PBST彻底洗涤之后，使用ECL蛋白质印迹检测系统在Hyperfilm ECL薄膜(Amersham(安马西亚)，美国)上检测蛋白条带(见图6A)。

功能性分析

使用来自表达VP6(牛轮状病毒蛋白)的幼虫[Ag(+)]或来自用非插入重组杆状病毒感染的幼虫[Ag(-)]的TSP提取物来包被ELISA微量平板(Polysorp，Nunc，丹麦)，在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6中以40μg/孔开始连续稀释，且在4℃温育过夜(O.N)。第二天，平板用PBST洗涤四次。平板相继在持续摇动下在37℃温育1小时，使用封闭溶液(PBST-2％BSA，100μl/孔)温育30分钟。然后，使用来自表达VHH的幼虫的TSP提取物，以2,5μg/孔稀释度处于封闭缓冲液中1小时。然后，平板用PBST洗涤4次，且再封闭30分钟。然后，加入100μl/孔的在兔中制备的针对VHH的多克隆抗体(1∶100稀释)，且在37℃温育1小时。平板用PBST洗涤4次。最后，加入100μl/孔的1∶2000稀释在封闭溶液中的抗-兔IgG-HRP标记的缀合物。对于底物反应，将平板洗涤4次，且向平板中加入100μl/孔的1mM 2，2′-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)ABTS，(KPL，美国)。允许过氧化物酶反应，以在室温下显色5-10分钟，且在ELISA微量平板读数仪(Multiskan EX，Thermo Electron Corp(热电公司)，美国)中在405nm处读取反应(见图7)。