假丝酵母发酵生产赤藓糖醇工艺优化研究

摘要

赤藓糖醇(Erythritol)是一种天然存在的四碳糖醇，化学名1，2,3,4-丁四醇，分子式C<,4>H<,10>O<,4>，分子量122.12，熔点126℃，沸点329～331℃，外观为白色粉状结晶.粉碎性好，溶于水会吸收较多能量，溶解热为-97.4J/g，食用时有一种凉爽的口感特征。在自然界中广泛存在于海藻、食用菌、甜瓜、葡萄、桃等植物或植物果实中。 赤藓糖醇是一种多羟基化合物，分子量小，大部分可以在小脑内快速吸收，在人体内及哺乳动物体内消化系统中的代谢方式与其它多元糖醇类不同，不参加糖代谢，生理耐受量高，故可在低能量食品中发挥作用，可供糖尿病、肥胖和低血糖病人食用；具有抗龋齿和促进双歧杆菌生长等生理功能。甜度约为蔗糖的60％～70％，而且其甜味在口腔内的残留时间非常短，大量动物实验证明赤藓糖醇是一种非常安全的糖醇。因此，赤藓糖醇作为低热量功能性保健食品甜味剂，具有广泛应用前景。 赤藓糖醇的制备方法主要为微生物发酵法，即以淀粉或淀粉糖为原料，由微生物在高浓度条件下发酵后提纯精制、浓缩、结晶、分离、干燥而得。目前国内从自然界中筛选的一株圆酵母在初始葡萄糖浓度为40％时，赤藓糖醇产量最高为120.0 mg/ml。国外分离筛选到一株高渗酵母在30％葡萄糖和4％玉米浆的培养基中经35℃发酵培养3天产量达到141.0 mg/mL。 目前，限制赤藓糖醇产业发展的关键因素是生产成本太高，主要原因是赤藓糖醇价格决定的，降低赤藓糖醇的生产成本是推动其产业发展的根本途径。对于工业赤藓糖醇生产菌株来说，其发酵培养基的选择不仅以赤藓糖醇的高产量为生产目标，还要重视产品生产成本。赤藓糖醇生产水平和底物转化率不仅与菌株自身的生理生化特性有关，还与培养基中的营养成分，含量以及发酵条件有直接的关系，并且通过对主要营养因素和发酵条件的优化可有效地提高底物的转化率。本研究旨在对实验室经紫外诱变、细胞融合后的高产赤藓糖醇假丝酵母进行培养基、培养条件优化，并对反应液中的赤藓糖醇分离纯化、结晶、鉴定，得到较佳的分离纯化工艺。 在菌株发酵条件优化时，首先采用单因素筛选法设计从碳源、氮源、无机盐、种子质量、温度、RH、发酵时间等用于假丝酵母发酵生产的营养基质和发酵条件中筛选影响赤藓糖醇产量的关键因素。然后采用正交试验分别对营养基质和发酵条件中各因素之间关系进行评价，得到最佳营养基质和发酵条件，并用SPSS统计软件进行结果分析。最后确立高产赤藓糖醇假丝酵母RH-UV-L4-F9培养条件为最适碳源是葡萄糖，初始葡萄糖浓度为30％；最适氮源为酵母膏、脲，初始浓度为0.5％酵母膏和0.1％脲；最适无机盐为 MgSO<,4>·7H<,2>O，初始浓度为0.5％；该菌的对数生长期在10～18h之间；最佳培养温度为32℃；发酵时间(发酵周期)为144h；初始培养基pH为5.0；接种量为10％。经上述条件培养后发酵液中赤藓糖醇含量为 157.5mg/ml，在同等条件下产量在国内处于领先水平。本研究对赤藓糖醇的分离纯化进行研究，确定了离子交换法分离提取赤藓糖醇的最佳条件，最佳洗脱体积，洗脱方法为每次上柱50ml样品，收集前200ml洗脱液；通过对离子交换流速的研究，确定了阴阳离子交换树脂的最佳脱色、除杂参数，流速为3ml/min时，得率和脱色率达到最大，分别为83.8％、100％；通过对发酵液纯化前后组分对比分析的研究，反应液内的杂质成分己基本去除，反应液中几乎只含有赤藓糖醇，达到了分离赤藓糖醇的效果，赤藓糖醇占干物质含量达到了96.91％；同时对发酵液浓缩，将初步浓缩的反应液进一步旋转蒸发浓缩至赤藓糖醇浓度为40％～50％，采用乙醇法对赤藓糖醇进行晶析：加入4倍体积的无水乙醇，并加入赤藓糖醇晶种，温度保持在4℃，静止10～12h，赤藓糖醇即可结晶。赤藓糖醇结晶过滤，用少量乙醇冲洗，然后于40℃条件下干燥10h，就可以得到赤藓糖醇晶体。并对结晶后产品纯度进行薄层层析法和高效液相法鉴定，纯化后的赤藓糖醇样品经薄层层析法检测，样品中只有赤藓糖醇一种糖醇，说明该方法达到了纯化的目的，样品经 HPLC检测，纯度达到95.6％，为赤藓糖醇的工业化生产提供了理论依据。 赤藓糖醇的研究与应用推广，不仅能提高人们的健康水平、推动我国的功能性食品行业的发展，而且通过采用生物技术的方法，可以加速吉林省玉米的高值转化，为吉林省的农产品加工开辟出一条新途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1赤藓糖醇的性质、功能特性及生产赤藓糖醇的研究进展

1.2国内外赤藓糖醇发酵工艺条件及其分离纯化技术状况

1.3本研究的内容和意义

第二章材料与方法

2.1仪器设备

2.2实验材料

2.3实验方法

第三章结果与讨论

3.1含量测定

3.2发酵条件优化

3.3赤藓糖醇分离纯化

3.4讨论

第四章结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

附录

致谢

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