柿子单宁的性质、结构及其与几种蛇毒蛋白的相互作用研究

摘要

本文采用无水甲醇为提取溶剂从柿子果肉中提取单宁,通过考察提取剂种类、提取温度、时间、提取次数及料液比等因素来确定了柿子单宁的最佳提取工艺；采用大孔树脂101结合超滤分离实现了柿子单宁的分离纯化及分级制备,得到了高分子量单宁(HMWT)和小分子量单宁(SMWT)两个级分。采用高效液相-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI-MS)对小分子结构进行了初步鉴定；采用凝胶渗透色谱(GPC)、傅立叶红外光谱(FT-IR)以及硫解和酸解结合HPLC-ESI-MS等方法分析了HMWT分子量分布以及单体结构；并对HMWT与SMWT在不同体系中的的抗氧化活性及HMWT与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用进行了系统研究；同时重点研究了HMWT在体外对江浙蝮蛇毒(AhPVP)、尖吻蝮蛇毒(AaVP)、眼镜蛇毒(NnaVP)中蛋白酶活的抑制能力及体内对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的解毒效果；并结合SDS-PAGE凝胶电泳、红外光谱(FT-IR)、圆二色谱(CD)初步研究了HMWT与蛇毒蛋白的相互作用机理。主要研究结果如下:
　　 1.柿子单宁的最佳提取工艺为:新鲜果肉去皮打浆后,以含1％HCL的无水甲醇作为提取介质,料液比1:12,90℃加热回流提取,提取3次,每次40min。
　　 2.提取液经大孔树脂101除糖去杂,聚砜超滤膜分级得到红色的HMWT粉末以及淡黄色SMWT粉末,HMWT缩合单宁(CT)含量93.4％,SMWT总酚(TP)含量为87.4％。两者具有典型的酚类物质显色特征,易溶于水,乙醇,甲醇等溶剂,其中HMWT在水中的最大溶解度为100mg/mL。
　　 3.经HPLC-ESI-MS鉴定SMWT主要为没食子酸及分子量分别为461,461,603的三个未知化合物。HMWT分子量分布在1.16×104u-1.54×1.04u之间,重均分子量1.39×104u,数均分子量1.28×104u,FT-IR表明HMW工具有原花青素的基本骨架结构,硫解和酸解的HPLC-ESI-MS表明其主要组成单体为:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG),(表)没食子儿茶素(E)GC及一种未知结构的单体。
　　 4.HMWT在2-脱氧-D-核糖体系,甲基紫体系,水杨酸体系中对羟基自由基的最大抑制率分别为90.47％、96.46％和87.77％；对邻苯三酚自氧化以及亚油酸脂质过氧比的最大抑制能力分别为56.57％和69.63％。在所有的体系中HMWT的抗氧化能力与加入量呈明显的剂量效应关系,且HMWT的抗氧化能力要优于相同浓度下的葡萄籽原花青素,大大强于SMWT,是柿子单宁抗氧化作用的主导成分。
　　 5.HMWT与明胶和BSA均具有较强的结合能力,明胶、BSA与HMWT质量比达到1.6:1时单宁沉淀率达到最大。HMWT与BSA结合的适宜条件为:温度40℃,反应时间30min,体系pH5.0,0.5mol/L的NaH2PO4为溶解介质。荧光光谱和紫外吸收光谱法分析表明,HMWT可以有规律地使BSA内源荧光猝灭,其猝灭机理可认为是HMWT与BSA形成复合物的静态猝灭、HMWT与BSA的作用力为疏水作用力和静电作用力,同时由F(o)rster非辐射能量转移理论计算得出HMWT与BSA结合位置的距离为1.63nm,结合位点0.99。
　　 6.HMWT溶液在光照、温度大于60℃、pH大于7条件下稳定性较差；具有较好的抗氧化性和抗还原性；食品添加剂中β-环状糊精有利于增加HMWT的热稳定性、淀粉在溶液中含量超过0.5％时易与HMWT发生复合作用,柠檬酸三钠对稳定性有较大的影响,柠檬酸、EDTA则影响较小；金属离子中Fe3+,AL3+,Zn2+对HMWT有着较强的结合作用,Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+则影响较小。
　　 7.当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1:1时,HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP中蛋白质水解酶、磷脂酶A2、L－氨基酸氧化酶、精氨酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、类凝血酶的酶活均基本完全抑制,且呈明显的剂量效应关系。
　　 8.HMWT对昆明小鼠腹腔注射的LD50值为301.84mg/kg,具有良好的安全性。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1:1时,HMWT对AhPVP,AaVP,NnaVP引起的肌肉毒性有极显著(p<0.01)的抑制作用,肌酸激酶(CK)的酶活抑制率分别为63.30％,55.06％,61.82％,肌肉组织病理学观察也显示出明显的剂量效应关系,高剂量组小鼠肌纤维损伤明显好转。当蛇毒蛋白与HMWT质量比为1:1时,HMWT能够极显著(p<0.01)降低AhPVP,AaVP引起的皮下出血,出血抑制率分别为98.6％,96.9％,HMWT对出血的抑制呈明显的剂量效应关系。
　　 9.5LD50剂量的AhPVP、AaVP、NnaVP注射入昆明小鼠腹腔后,口服灌胃HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长4-6倍、3.5倍和2-4倍,高剂量的HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒小鼠存活率分别提高到75％、50％和25％。
　　 腹腔注射HMWT后可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长15－30倍、15－20倍和5－15倍,高剂量组对各种蛇毒的解毒作用强,小鼠存活率达100％。静脉注射HMWT对小鼠的急救效果最佳,HMWT中剂量组即可使各组小鼠存活率达100％,低剂量组也能大大延长存活时间并且存活率分别达到了50％、75％、50％。三种解救方式对蛇毒引起的毒害均有急救效果,口服灌胃虽然存活率不高但能有效的延长存活时间,而腹腔注射和静脉注射则能有效提高存活率。
　　 口服预防给药HMWT可使AhPVP、AaVP和NnaVp所致的染毒死亡小鼠平均存活时间分别延长3-5倍、3-5倍和1－3倍,说明服用HMWT对蛇毒引起的毒害有一定的预防作用。
　　 10.SDS-PAGE结果表明HMWT与蛇毒蛋白结合形成沉淀是导致酶失活的重要因为,虽然HMWT对蛇毒中蛋白质组分的结合表现出一定的非特异性,但对不同组分结合能力和选择性明显不同,且为非可逆结合。AhPVP经Sephadex G－75两次纯化及DEAE Sephadex A-50离子交换层析得到分子量14000的电泳纯磷脂酶A2。红外及圆二色谱结合表明,HMWT中的酚羟基与PLA2中的氨基的相互作用在结合过程中起着重要的作用,且HMWT对PEA2的a－螺旋结构有强烈的破坏作用。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 前言

1 柿子资源综合利用现状

1.1 柿子果肉的综合利用

1.2 柿叶的综合利用

1.3 柿皮和柿蒂的综合利用

2 柿子果肉单宁的国内外研究进展

2.1 柿子单宁结构分析的研究进展

2.2 柿子单宁生理活性的研究进展

3 研究目的、意义及内容

第二章 柿子单宁提取工艺的优化

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器设备

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1.柿子果肉的基本成分分析

2.2 柿子单宁的提取工艺及含量测定

2.3 不同品种、柿子不同组织单宁含量的比较分析

3 讨论

第三章 柿子单宁的分离纯化及结构分析

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器设备

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 柿子单宁的大孔吸附树脂纯化工艺

2.2 柿子单宁的超滤分级工艺

2.3 SMWT及HMWT的基本特性

2.4 柿子单宁不同级分的HPLC及HPLC-ESI-MS分析

2.5 HMWT的GPC分析

2.6 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析

2.7 HMWT硫解、酸水解产物的HPLC及HPLC-ESI-MS分析

2.8 HMWT的单体的结构鉴定

3 讨论

3.1 柿子单宁的分离纯化工艺

3.2 柿子单宁各级分的结构鉴定

第四章 柿子单宁抗氧化活性、蛋白质结合能力及稳定性研究

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器设备

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 柿子单宁的抗氧化能力

2.2 HMWT与蛋白质的相互作用

2.3 HMW溶液的稳定性

3 讨论

第五章 HMWT与蛇毒蛋白的相互作用及解毒研究

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器设备

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 HMWT对蛇毒中主要酶活力的影响

2.2 HMWT急性毒性试验

2.3 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP所致的小鼠肌肉毒性的影响

2.4 HMWT对AhPVP、AaVP所致的小鼠皮下出血的影响

2.5 HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用

2.6 预防给药HMWT对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠的体内解毒作用

2.7.AhPVP中PLA2的纯化

2.8.AhPVP、AaVP、NnaVP及PLA2与HMWT的相互作用

3 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录