影响猪肌肉生长及肉质相关四个候选基因的分离、鉴定

摘要

肌肉生长与肌肉品质性状的改良一直是家畜育种工作的主要目标之一。作为动物体内最丰富的组织，其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状。近年来，随着一批影响肌肉生长与肌肉品质主效基因（如氟烷敏感基因和酸肉基因）的分离与鉴定及分子标记技术的迅速发展，以分子标记辅助选择与渗入为特色的分子育种技术与常规育种技术相结合极大的加速了猪遗传改良的进程。而分子育种技术的有效开展依赖于大量影响猪肌肉生长及肌肉品质性状主效基因或分子标记的分离与鉴定。鉴于此，本研究充分利用猪 QTLs定位信息、人-猪比较基因组学图谱及四月龄大白猪与梅山猪背最长肌基因差异表达结果，结合基因的生理生化功能及参与的信号通路，选取了四个影响猪肌肉生长发育和品质的功能候选基因进行了进一步研究。具体研究结果如下：
　　1.猪melusin基因
　　（1）全长cDNA序列的克隆与鉴定。结合EST序列拼接及cDNA末端快速扩增的方法，获得了猪melusin基因1253 bp的cDNA序列（GenBank序列号为DQ002920）。比较发现猪melusin与人、黑猩猩、猕猴、牛、大鼠、小鼠的同源性较高（>86%）且与牛melusin的遗传进化关系最近。
　　（2）品种特异性转录本的分离与鉴定。在大白猪背最长肌cDNA中发现了一个在大白猪中特异表达的转录本。该转录本由于外显子2转录了内含子1中的106 bp的序列而产生。经RACE等方法扩增，得到该转录本1359 bp的全长序列（FJ447492）。预测发现该转录本最大的读码框架为479 bp-1150 bp，并与野生型保持同一读码框架，编码223个氨基酸。同时对该转录本在不同猪种和不同时期的背最长肌的表达情况进行了鉴定。
　　（3）全长基因组序列的分离与鉴定。根据不同物种melusin基因的同源性以及猪melusin基因cDNA序列，获取了猪melusin基因5872 bp的基因组序列，包含了全部11个外显子和10个内含子，且所有的内含子和外显子的拼接都符合GT/AG法则。
　　（4）启动子区序列的获取及生物信息学分析。利用不同物种melusin基因上游序列的保守性，得到了797 bp的上游序列。该序列与经Gene2Promoter回收的人和鼠的该基因的启动子区的序列同源性达到了80%和73%。利用 NNPP、MatInspetor、MotifFinder、CPGPLOT、SIGNALSCAN等软件对该基因核心启动子区、转录起始位点以及转录因子结合位点进行了预测和分析。
　　（5）组织表达谱分析。利用半定量RT-PCR方法对猪melusin基因不同转录本在大白猪不同组织中的表达情况进行了分析。结果表明，猪melusin基因不同转录本在4月龄大白猪背最长肌、心脏和脾脏中高量表达，在肝脏和肾脏中有微弱表达，在肺脏和卵巢中只检测到了野生型转录本的表达，其中在卵巢中表达量高，在肺脏中微弱表达。在脂肪组织、小肠和胃中未检测到该基因的表达。
　　（6）多态性检测。利用重叠引物分别在大白猪、梅山猪和长白猪中扩增melusin基因的基因组序列进行比对，结果共发现了25处潜在的SNP位点。经进一步验证后发现，在5’调控区的G419C、内含子1中A902G、内含子4中C3595T分别引起了PstI、RsaI、BstHHI酶切位点的改变。对这3个SNP位点分别在不同纯种猪中分型结果表明，在大白猪和长白猪中，只检测到419C-902G-3595C等位基因的存在。而在梅山猪中只存在419G-902A-3595T等位基因。由此确定，这3个SNP位点存在高度的连锁不平衡，即处于共分离装态。在“大白×梅山”资源家系F2代群体中的进一步分型验证了上述推测。
　　（7）单倍型构建及遗传效应分析。对这3个SNP位点构建了单倍型并对不同基因型个体与性状间的相关性进行了分析。结果表明，不同基因型个体在骨率、瘦肥比率、肩部最后处背膘厚、6-7肋骨处背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、板油重和花油重等性状存在极显著差异。在眼肌高、眼肌宽和皮率性状上存在显著差异。CGC/CGC基因型个体比GAT/GAT和CGC/GAT基因型个体相比具有较高的眼肌面积和眼肌宽，较低的背膘厚和眼肌高。与肉质性状的相关性分析表明，不同基因型个体在股二头肌色值、股二头肌大理石纹、背最长肌大理石纹、肌内脂肪和肌内水分等性状间存在显著或极显著相关。CGC个体具有较高的股二头肌色值和较高的肌内水分含量，而 GAT个体具有较高的股二头肌大理石纹、背最长肌大理石纹和肌内脂肪含量，其基因效应主要以加性效应为主。
　　2.猪APOM基因
　　（1）cDNA序列的克隆与鉴定。结合EST序列拼接及物种同源性比较，获取了742 bp的猪 APOM基因 cDNA序列（DQ329240）。ClustalW比较发现猪APOM与人、黑猩猩、猕猴、牛、大鼠、小鼠等存在较高的同源性（>85%），且与牛的APOM遗传进化关系最近。
　　（2）全长基因组序列的分离与鉴定。根据BAC克隆（BX548169）序列信息，设计引物获取了3621 bp的猪APOM基因的全长基因组序列，其中包含1261 bp的5’上游序列。该基因由6个外显子和5个内含子，且所有的内含子和外显子的拼接都符合GT/AG法则。
　　（3）启动子区序列生物信息学分析。对获取的1261 bp的5’上游序列及完整的外显子1序列，利用 NNPP、MatInspeto、MotifFinder、CPGPLOT、SIGNALSCAN等软件对该基因核心启动子区、转录起始位点以及转录因子结合位点进行了预测和分析。发现该区域存在典型的TATA box特征的核心启动子区，并将转录起始位点推测在1136 bp处。
　　（4）猪APOM基因的比较定位。根据人HAS6p与SSC7p及着丝粒区存在的广泛的线性同源性，及对猪 APOM基因附近的基因的定位信息的挖掘，发现猪APOM基因位于猪白细胞抗原基因（SLA）I型基因簇区，并将其定位在SSC7p1.1区域。
　　（5）组织表达谱分析。利用半定量RT-PCR方法对猪APOM基因在大白猪不同组织中的表达情况进行了分析。结果发现猪 APOM基因在肝脏和肾脏中高量表达，在脂肪组织和卵巢中检测到了微弱表达，在其他组织中未检测到该基因的表达。
　　（6）多态型检测。比较大白猪、长白猪和梅山猪 APOM基因的序列差异发现了16处潜在的 SNP位点。其中内含子2中2289位的 G/C突变引起了ECO130I酶切位点的改变。对该SNP位点在不同纯种猪中的分型结果表明，在国外品种大白猪和长白猪中，G等位基因占多数，而在国内品种梅山猪中 C等位基因占多数。
　　（7）G2289C遗传效应分析。对猪APOM基因G2289C位点在“大白×梅山”F2群体中进行了分型，并与胴体性状和肉质性状的相关进行了分析。结果表明，不同基因型个体在骨率、皮率、肩部最厚处背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、板油重和眼肌宽等性状存在显著或极显著差异。GG基因型倾向于具有较高的骨率和皮率，较低的背膘厚，且基因的遗传效应以加性效应为主。与肉质性状的关联分析表明，不同基因型个体只在股二头肌pH性状上存在显著差异，在其它肉质性状中未检测的显著差异。
　　3.猪DMPK基因
　　（1）背最长肌中差异表达验证。该基因是从利用基因芯片技术筛选四月龄大白猪和梅山猪背最长肌差异表达基因时筛选出来的。其在大白猪中的表达量要显著高于在梅山猪中的表达量。设计引物分别用半定量 RT-PCR和实时定量RT-PCR技术鉴定了猪DMPK基因在背最长肌中的差异表达。
　　（2）cDNA序列的分离与鉴定。根据物种同源性及EST拼接序列，设计引物扩增得到了2673 bp的猪DMPK基因的cDNA序列，编码624个氨基酸（3）全长基因组序列的分离与鉴定。根据不同物种该基因的同源性及获取的猪DMPK基因cDNA序列与人DMPK基因组序列的Spidey比对结果，设计引物获取了11742 bp的猪DMPK基因全基因组序列，其中包含1745 bp的上游调控区序列。经比对发现，该基因有15个外显子组成，且其外显子与内含子的拼接位点的序列均符合GT/AG法则。
　　（4）启动子区序列生物信息学分析。对获取的1745 bp的5’上游序列及完整的外显子1序列，利用 NNPP、MatInspeto、MotifFinder、CPGPLOT、SIGNALSCAN等软件对该基因核心启动子区、转录起始位点以及转录因子结合位点进行了预测和分析。
　　（5）组织表达谱分析。利用半定量RT-PCR方法对猪DMPK基因在大白猪不同组织中的表达情况进行了分析。结果发现猪 DMPK基因在背最长肌中表达量最高，在心脏、脾脏、脂肪组织中中量表达，在胃和卵巢中微弱表达。
　　4.猪G6PT基因
　　（1）背最长肌中差异表达验证。该基因是从利用基因芯片技术筛选四月龄大白猪和梅山猪背最长肌差异表达基因时筛选出来的。其在大白猪中的表达量要显著高于在梅山猪中的表达量。设计引物分别用半定量 RT-PCR和实时定量RT-PCR技术鉴定了猪G6PT基因在背最长肌中的差异表达。
　　（2）cDNA序列的分离与鉴定。结合EST序列拼接和RACE技术获取1925 bp的猪G6PT基因的cDNA序列。比较发现猪G6PT与人、狗、大鼠和小鼠存在高的同源性（>93%），且遗传进化关系与人和狗最近。
　　（3）全长基因组序列的分离与鉴定。根据不同物种该基因的比对结果及获取的1925 bp的cDNA序列，获取了5077 bp的全基因组序列。经比对发现，该基因由9个外显子和8个内含子组成，且其外显子与内含子拼接位点的序列均符合GT/AG法则（4）组织表达谱分析。利用半定量 RT-PCR方法对猪 G6PT基因在大白猪不同组织中的表达情况进行了分析。结果发现猪 G6PT基因背最长肌中高量表达，在心脏中量表达，在肝脏和肾脏中有微弱表达，在脾脏、肺脏、脂肪组织、胃、小肠、卵巢中不表达。

目录

资源家系测定性状的英文缩写

第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 猪肌肉生长发育及品质相关的候选基因研究进展

1.3基因差异表达的研究方法

1.4 电脑克隆在分离新基因中的应用

1.5 拟分离基因的研究现状

第二章 研究的目的和意义

第三章 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 试验方法

第四章 结果与分析

4.1 猪基因组DNA以及总RNA的提取与质量检测结果

4.2 猪melusin基因

4.3 猪APOM基因

4.4 猪DMPK基因

4.5 猪G6PT基因

第五章 讨 论

5.1. 关于候选基因的筛选

5.2 利用电子克隆策略分离猪新基因

5.3 猪与其他物种基因组和氨基酸的保守性

5.4 关于半定量和实时定量PCR

5.5 内含子SNPs的遗传效应分析

5.6 分子标记在不同猪群间基因频率分布

5.7 分子标记的遗传效应分析

5.8 关于下一步工作

小结

参考文献

致谢