用于动物性食品中莱克多巴胺快速检测的SPR技术研究

摘要

莱克多巴胺是一种双苯烷胺类β-肾上腺素受体兴奋剂。与其他β-兴奋剂一样,当莱克多巴胺的用量超过临床用量的4-9倍时,具有良好的营养重分配和生长促进作用。但其在动物体内的残留一旦通过食物链进入人体,会对食用者的安全产生极大的危害。目前,我国已经禁止将β-兴奋剂作为动物营养生长促进剂使用。但长久以来,各种因非法使用β-兴奋剂造成的中毒事件时有发生。随着国家对瘦肉精(盐酸克伦特罗)打击力度的加大,莱克多巴胺作为其替代品越来越多的被非法添加。中国现有的确证检测方法为中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》SN/T1924-2007。筛选方法为常规酶联免疫法吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。色谱法检测前处理麻烦,耗时且仪器操作复杂,无法实现样品的高通量检测。常规酶联免疫吸附法,检测时间较长,每次分析需要至少3个小时,而且需要标记二抗,底物和浓硫酸对人体有害。因此,建立快速、灵敏、有效、安全的莱克多巴胺残留检测方法具有重要意义。
　　 随着生物技术的发展,诞生了生物传感器技术,生物传感器(Biosensor)是一种对生物物质敏感并将浓度转换为电信号进行检测的仪器。是以固定化的生物敏感材料作为识别元件(包括酶、抗原、抗体、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质),以氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等作为理化换能器,外加信号放大装置共同构成的分析工具。表面等离子共振(SPR)免疫传感器作为生物传感器的一种,是以抗体为识别元件,利用光敏管作为换能器的光学传感器。与常规ELISA相比,具有很多优点。首先,样品无需标记,可保持样品的生物活性与简化操作；其次,SPR自动化程度高,是一种实时监测工具,可以对生物分子相互作用的全过程进行动态检测和分析。另外,SPR检测的样品用量少,抗原抗体的用量大约为常规EIJSA的1/100-1/10。且可对样品进行回收处理。SPR检测样品的时间短,可实现高通量的筛选。另外,SPR和常规ELISA类似,对大部分样品的检测也都无需进行前处理。因此,SPR被用于小分子残留物的检测和生物分子的相互作用的动力学分析。
　　 进行免疫分析的关键步骤之一,是合成免疫抗原获得高效价和高特异性的抗体。本研究合成了莱克多巴胺的人工全抗原,通过免疫兔子获得了多克隆抗体。
　　 采用多元酸酐与混合酸酐法合成了莱克多巴胺的人工抗原。通过紫外扫描法、红外扫描法和SDS-PAGE凝胶电泳对人工抗原进行了鉴定,证实了人工抗原合成成功。
　　 用合成的人工抗原作为免疫原采用背部皮下五点注射法免疫家养大白兔。以与合成免疫原相同的方法合成了包被原,对抗血清进行检测,免疫七次后,获得了效价为1:200000的莱克多巴胺多克隆抗血清。与硫酸庆大霉素、沙丁胺醇及克伦特罗等类似物的交叉反应率均小于0.01％,对莱克多巴胺的检出限为0.400ng/mL,抗体具有较高的特异性。
　　 利用SPR对莱克多巴胺多克隆抗体与莱克多巴胺的结合反应进行了动力学分析,得到其亲和常数为4.48275E-7M,具有较高的亲和力。
　　 以自组装单层膜法修饰芯片,将RAC-OVA.偶联物固定在芯片上,优化得到固定化条件为10mmol/LpH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液为耦合缓冲液,全抗原浓度为10μg/ml,EDC/NHS活化时间为7min,全抗原的反应时间为20min下,固定化具有良好的重现性。
　　 以莱克多巴胺的抗体为识别元件,采用间接竞争法,将抗体与不同浓度的莱克多巴胺混合后流过固定了RAC-OVA偶联物的SPR芯片表面来构建标准曲线。竞争标准曲线的最低检出限为0.12ng/mL,线性范围为0.28ng/mL-4.29ng/mL,IC50为1.17ng/mL。添加回收试验将SPR检测结果与ELISA结果和HPLC-MS-MS进行了方法比对,SPR方法的准确性和精密度良好,回收率也在可接受范围,该方法可用于动物性食品中莱克多巴胺的检测,并且该方法可扩展到食品中其他小分子农兽药污染物的检测。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 绪论

1.1 食品安全农兽药残留问题日益凸显

1.1.1 农兽药残留问题

1.1.2 现有的主要农兽药残留检测方法

1.1.3 兽药残留中的莱克多巴胺残留

1.2 SPR生物传感器的研究现状

1.2.1 SPR传感器的原理

1.2.2 SPR传感器的应用进展

1.2.3 SPR用于食品中农兽药残留检测的研究进展

1.4 本论文的研究内容和意义

第二章 莱克多巴胺免疫原的合成

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 合成实验原理

2.1.3 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 莱克多巴胺全抗原的紫外光谱分析

2.2.2 莱克多巴胺全抗原的红外光谱分析

2.2.3 莱克多巴胺全抗原的电泳分析结果

2.3 本章小结

第三章 莱克多巴胺多克隆抗体的研制

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 实验动物的适应性

3.2.2 莱克多巴胺多克隆抗体纯化结果

3.2.3 抗体效价测定

3.2.4 方阵滴定实验

3.2.5 竞争ELISA的标准曲线

3.2.6 ELISA的交叉反应

3.3 本章小结

第四章 全抗原在芯片表面的固定化

4.1 固定化方法概述

4.2 实验方法

4.2.1 固定化流程

4.2.2 固定化条件的探索

4.3 结果与分析

4.3.1 单分子层形成的重复性

4.3.2 耦合缓冲液对固定量的影响

4.3.3 全抗原浓度对抗原固定量的影响

4.3.4 EDC/NHS活化时间对抗原固定量的影响

4.3.5 全抗原反应时间对抗原固定量的影响

4.3.6 固定化的重复性

4.4 本章小结

第五章 SPR检测莱克多巴胺

5.1 实验原理

5.2 反应的结果处理

5.3 实验仪器与试剂

5.3.1 仪器

5.3.2 主要试剂

5.3.3 相关溶液的配制

5.4 实验方法

5.4.1 SPR反应条件的优化

5.4.2 SPR检测方法标准曲线的构建

5.4.3 ELISA检测方法标准曲线的构建

5.4.4 SPR与ELISA检测基质样品及GC-MS-MS方法的比对

5.5 结果与分析

5.5.1 芯片表面的非特异性吸附的研究

5.5.2 反应缓冲液的选择

5.5.3 再生条件的研究

5.5.4 抗体浓度的选择

5.5.5 SPR检测方法标准曲线的构建

5.5.6 ELISA检测方法标准曲线的构建

5.5.7 SPR与ELISA及HPLC-MS-MS方法的结果比对

5.6 本章小结

第六章 抗原抗体的反应动力学分析

6.1 实验原理

6.2 实验方法

6.2.1 抗原的固定

6.2.2 动力学常数的测定

6.3 结果与分析

6.3.1 Langmuir吸附等温线分析

6.3.2 速率方程积分分析

6.4 本章小结

参考文献

致谢