动物性食品中氨苯砜免疫快速检测技术的研究

摘要

氨苯砜(dapsone，DDS)为砜类抑菌剂，大剂量使用时会显示出较强的杀菌作用，常被用来预防和治疗动物疾病。但是氨苯砜的毒性较大，会引起血液系统反应，会对某些器官造成一定的损害，最严重的甚至可以导致人体死亡，因此我国农业部规定禁止在所有食品动物中使用，且不得在动物性食品中检出;欧盟2377/90、37/2010也明确规定氨苯砜是禁用药物。本文设计合成DDS人工抗原，制备出了针对DDS的多克隆抗体，初步建立了检测DDS的dcELISA法和GICA法，两者对DDS的残留进行快速检测都表现出较好的灵敏度和特异性。
　　利用重氮化法将DDS与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联制备出免疫原DDS-BSA，利用戊二醛法将DDS与卵清蛋白(OVA)进行偶联制备出包被原DDS-OVA，采用过碘酸钠法将DDS与HRP相连制备了酶标抗原DDS-HRP。用免疫原DDS-BSA对健康的新西兰大耳白兔进行多点免疫。免疫三个月后，新西兰大耳白兔产生的抗血清效价为1∶12800，将抗血清用ProteinA-Sepharose4B凝胶柱亲和层析法进行纯化，得到针对DDS的单一特异性抗体。
　　通过对包被抗体浓度及酶标抗原稀释浓度、封闭液、离子浓度、pH值及乙腈含量等条件进行优化，在最优条件下，建立了DDS的直接竞争酶联免疫吸附法，该方法IC50为2.96μg/L，IC15为0.02μg/L，与二苯砜、4，4—二羟基二苯砜、磺胺和磺胺嘧啶等结构类似物的交叉反应率分别为1.38％、0.75％、17.22％和11.17％，表明此方法具有较高的特异性，板内变异系数范围为3.47％～12.12％，板间变异系数范围为5.22％～12.16％，证明该法的稳定性较好。牛奶需10倍稀释、蜂蜜需5倍稀释、猪肉和鸡蛋需吹干后复溶，可有效消除基质。设三个水平，结果ELISA回收率在75.45％～90.48％之间，通过常规的HPLC法对ELISA结果进行验证，结果显示R2为0.9937。证明，所建立的直接竞争ELISA方法可以用来对动物源性食品中残留的DDS进行快速定量检测。
　　以硝酸纤维素膜为固相载体，包被DDS-OVA为检测带（T带），羊抗兔抗体为质控带（C带），在最优条件下，开发了快速检测胶体金试纸条，最低检出限为20μg/L。牛奶提取液用PBS缓冲液直接稀释5倍、猪肉和蜂蜜稀释10倍，鸡蛋稀释20倍可基本消除基质溶液的影响。该试纸条操作简便、快速，广泛应用于大批量临场动物性食品中DDS的残留快速定性检测。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 动物源性食品安全现状

1．2 兽药残留

1．3 氨苯砜概述

1．4 氨苯砜残留的危害

1．5 氨苯砜的残留限量规定

1．6 氨苯砜常规检测技术

1．6．1 高效液相色谱法(HPLC)

1．6．2 高效液相色谱法-质谱联用法(HPLC-MS)

1．7 氨苯砜免疫检测技术

1．7．1 酶联免疫吸附技术(ELISA)

1．7．2 免疫胶体金技术(GICA)

1．8 本研究的目的、意义及内容

1．8．1 研究目的及意义

1．8．2 研究内容

2 氨苯砜免疫原及包被原的制备及鉴定

2．1 材料

2．1．1 药品及试剂

2．1．2 缓冲溶液体系

2．1．3 仪器及设备

2．2 方法

2．2．1 DDS免疫原和包被原的合成

2．2．2 DDS-BSA偶联物的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 目测法鉴定偶联物的合成

2．3．2 紫外分光光度计法鉴定偶联物的合成

2．3．3 SDS-PAGE电泳分析法鉴定DDS-BSA的合成

2．4 本章小结

3 氨苯砜多克隆抗体的制备及纯化

3．1 材料

3．1．1 药品及试剂

3．1．2 缓冲溶液体系

3．1．3 仪器及设备

3．1．4 试验动物与饲养条件

3．2 方法

3．2．1 DDS多克隆抗体的制备

3．2．2 抗血清效价的测定

3．2．3 DDS抗体纯化及浓度的测定

3．2．4 间接ELISA测定抗体亲和力

3．3 结果与分析

3．3．1 间接ELISA法测定血清效价

3．3．2 抗体纯化及浓度测定

3．3．3 抗体亲和力的测定

3．4 本章小结

4 氨苯砜直接竞争ELISA方法的建立及验证

4．1 材料

4．1．1 药品及试剂

4．1．2 仪器及设备

4．1．3 试验样品

4．2 方法

4．2．1 过碘酸钠法合成酶标抗原(DDS-HRP)

4．2．2 ELISA法测定抗体亲和力

4．2．3 包被抗体浓度和酶标抗原工作浓度的初步确定

4．2．4 直接ELISA反应体系条件的优化

4．2．5 dcELISA标准工作曲线的建立

4．2．6 ELISA样品的检测

4．2．7 高效液相色谱法(HPLC)验证

4．3 结果与分析

4．3．1 ELISA法测定抗体亲和力

4．3．2 直接ELISA法包被抗体浓度和酶标抗原工作浓度的初步确定

4．3．3 直接ELISA反应体系条件的优化

4．3．4 dcELISA标准曲线的建立

4．3．5 ELISA样品的检测

4．3．6 高效液相色谱法(HPLC)验证

4．4 本章小结

5 胶体金标记免疫检测技术及其应用

5．1 材料

5．1．1 药品及试剂

5．1．2 仪器及设备

5．1．3 试验样品

5．2 方法

5．2．1 胶体金的制备

5．2．2 免疫金的制备

5．2．3 胶体金标记试纸条的制备

5．2．4 胶体金试纸条检测条件的优化

5．2．5 样品的测定

5．3 结果及分析

5．3．1 胶体金质量的鉴定

5．3．2 胶体金与DDS抗体结合最适pH值的确定

5．3．3 稳定1 mL胶体金所需抗体最小量的确定

5．3．4 胶体金试纸条检测条件的优化

5．3．5 最低检出限的确定

5．3．6 样品基质的消除

5．3．7 添加回收率

5．4 本章小结

6 结论

6．1 全文总结

6．1．1 氨苯砜免疫原及包被原的制备及鉴定

6．1．2 dcELISA分析方法的建立及应用

6．1．3 胶体金标记免疫检测技术的建立及其应用

6．2 本研究的创新点

6．3 本研究的不足之处

6．4 展望

参考文献

作者简介

攻读硕士期间发表的论文

致谢