调节NMD通路中SMG5的miR-433的鉴定及miRNA-NMD-作用底物调控通路的初步研究

摘要

在真核细胞的进化过程中形成许多mRNA质量监控机制来实现基因的准确表达，其中无义介导的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）是一种重要的转录后监控机制，可识别含提前终止密码子（prematureterminationcodons，PTC）的异常mRNA并对其进行降解，有效避免产生的截短蛋白对细胞的毒害。其中，SMG5在NMD中扮演着重要的角色，SMG5是一个编码蛋白基因，没有核糖核酸酶活性，但对逆转录酶的活性有促进作用，它和SMG7一起被认为与涉及核酸外切途径的mRNA降解机制存在联系—通过招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脱磷酸化。
　　microRNA(miRNA)是一类长度约为19-24nt内源性保守单链非编码小分子RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的3'UTR特异互补结合，在转录后水平上调节靶mRNA的表达或者阻止蛋白的翻译，目前研究表明，miRNA参与了许多生理及病理的过程，例如，参与了肿瘤的发生发展和转移、细胞凋亡、细胞增殖和分化的生物化学过程等。但是目前有关miRNA参与NMD通路的报道比较少，因此，作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介导mRNA的降解是一个值得研究的课题，本试验以NMD通路中的关键因子SMG5为研究对象，通过生物信息学的方法筛选出潜在的以SMG5为靶基因的miR-433。并利用分子生物学方法研究二者的作用关系，以及在NMD通路中所发挥的作用。主要的研究结果如下:
　　(1)生物信息学预测潜在调控SMG5的miRNAs。利用生物信息学软件TargetScan等对作用于SMG53'UTR的miRNA进行预测，结果得到了多个miRNAs，经过筛选最终确定miR-433作为研究对象。
　　(2)组织表达谱的构建。利用实时定量PCR技术检测miR-433和SMG5在小鼠心、肝、肾等十二种组织的表达量，并绘制了组织表达谱。结果显示:SMG5基因在小鼠组织中广泛表达，miR-433在脑和肌肉中表达量较高。
　　(3)双荧光素酶报告基因的检测。根据miR-433与SMG5基因的3'UTR结合序列，构建了野生型和突变型荧光素酶报告基因pmirGLO载体。并将这两种质粒分别与miR-433mimic和miR-433inhibitor共转入HEK-293T细胞、Hela细胞，检测相应的荧光活性，结果表明:miR-433与SMG5之间存在负调控的关系。
　　(4)miR-433调控SMG5的表达检测。miR-433mimic转染BHK细胞后，利用RT-PCR和Westernblot检测SMG5的表达量，结果发现:SMG5的mRNA表达量显著下降(P＜0.01)，miR-433也降低了SMG5蛋白水平;而将miR-433inhibitor转染C2C12细胞后，得到的结果刚好相反，SMG5的表达量显著上升(P＜0.01)，miR-433inhibitor上调了SMG5的蛋白水平。
　　(5)利用荧光定量PCR和westernbolt检测miR-433调控SMG5底物基因GADD45B、TBL2的表达。将miR-433mimic转染细胞后，利用荧光定量PCR和westernbolt检测NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表达，结果显示:miR-433上调了TBL2、GADD45B的表达，进一步推断miR-433参与NMD通路。
　　(6)干扰SMG5对底物基因的影响。利用SMG5基因的siRNA，转染C2C12细胞，实时荧光定量PCR检测SMG5被干扰后底物基因TBL2、GADD45B的表达量，结果显示:干扰24h后，SMG5表达量较对照组显著下降(P＜0.01)，而TBL2、GADD45B则有不同程度的上升(P＞0.05);进行Westernbolt试验，所得的结果与此相符。
　　从以上结果，我们推断miR-433能够通过抑制SMG5的表达参与NMD通路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 前言

1．1 NMD是真核细胞中mRNA降解的重要监督机制

1．2 NMD途径的作用因子和底物基因

1．3 NMD与疾病的关系

2 miRNA的生物过程及与靶基因的调控机制

2．1 miRNA生物过程

2．2 miRNA与靶基因的调控机制

3 miRNA靶基因的预测与检测方法

4 研究的目的和意义

第二章 材料方法

1 实验材料

1．1 实验样品

1．2 主要试剂及药品

1．3 常用试剂的配制

1．4 主要应用到的生物信息学网站和分析软件

2 试验方法

2．1 生物信息学预测SMG5调控相关的miRNAs

2．2 mRNA和miRNA组织表达谱的检测

2．3 双荧光素酶报告载体的构建

2．4 细胞培养与转染

2．5 miRNA的超表达和抑制表达

2．6 western boltting检测靶基因的水平

2．7 干扰SMG5对NMD底物基因的影响

第三章 结果分析

1 作用于SMG5的miRNA的预测

2 mRNA和miRNA的组织表达谱分析

2．1 组织总RNA的质量检测

2．2 cDNA结果检测

2．3 SMG5在小鼠各个组织中的表达谱分析结果

2．4 miRNA在小鼠各组织中的表达谱分析结果

3 双荧光素酶报告载体的构建与鉴定结果

3．1 野生型双荧光素酶报告载体的构建

3．2 突变型双荧光素酶报告载体的构建

3．3 双荧光素酶报告基因的检测结果

4 miR-433超表达和抑制表达试验结果

4．1 荧光显微镜下mimic转染效率检测

4．2 实时定量PCR检测miR-433的超表达和抑制表达结果

4．3 荧光定量PCR检测miR-433对SMG5的调控

4．4 SMG5的Western blotting检测结果

5 NMD底物基因调控研究结果

5．1 实时荧光定量PCR检测下游基因的表达

5．2 底物基因的Western blotting检测结果

5．3 干扰SMG5基因对底物基因表达的影响

第四章 讨论

1 miR-433功能和作用的靶基因

2 SMG5在NMD通路的作用

3 miRNA-433通过调控SMG5来参与NMD通路及其意义

4 关于本研究涉及到的实验技术和方法的讨论

4．1 关于实时荧光定量PCR

4．2 关于Western bolt

第五章 小结

参考文献

附录

致谢