影响卵白蛋白的S-构型转变因素及测定方法研究

摘要

本文对卵白蛋白在体外和体内环境下的构象变化及S-卵白蛋白的测定方法做了研究，利用紫外光谱、红外光谱、ANS荧光探针和圆二色谱研究了两种提取方法即聚乙二醇沉淀法与超滤法对卵白蛋白转变为S-构型的影响。聚乙二醇法的最大紫外吸光值，从0h时的0.613，降到24h的0.421，荧光强度，0h为385，24h为580,两步超滤法，紫外吸光值从0h时的0.554，降到24h的0.247；荧光强度，0h为367，到24h为556，聚乙二醇沉淀法制得的卵白蛋白的二级结构由无规卷曲结构(23.3%)经24h诱导处理后,无规卷曲结构减少(22.1%)。而超滤法制得的卵白蛋白由无规卷曲结构(23.0%)，24h后,无规卷曲结构减少(22.3%)。超滤法分离卵白蛋白与其他蛋白的效果较聚乙二醇沉淀法对S-卵白蛋白的二级结构影响较小。
　　利用紫外光谱，ANS荧光探针，红外光谱和圆二色谱测定了卵白蛋白在不同pH溶液中的构象转变情况。酸性条件下，pH=7时的吸光度为0.0862，到pH=4时降到0.0837.当pH下降到4以后，紫外吸收峰明显增强，pH=2时，280nm处达到0.1067，卵白蛋白的构象变化，发生酸水解；pH值为2的环境中,卵白蛋白的荧光强度为392,pH为7时为604，意味着在这种环境中蛋白质的表面疏水性变大。pH从7降到2时，卵白蛋白的有序结构减少，无规卷曲结构增加，从23.2%变为24.5%；碱性条件，从pH=7时的紫外吸光值0.0862，到pH=12时增长至0.1245，荧光光谱，pH=7时的604到pH=9时的626，当pH超过10，卵白蛋白的荧光强度有明显的升高，pH=12时，达到730.卵白蛋白的二级结构，pH从7升至10时，有序结构增加，无规卷曲结构减少，从23.2%变为21.7%；pH>11，蛋白质分子伸展，无规则卷曲结构明显增加，为32.1%。对比第二章结果，可能是由于碱性环境诱导卵白蛋白向S-构型转化。
　　测定了在不同贮藏温度下（4℃、22℃和37℃），卵白蛋白的构象变化。随着时间的增加，卵白蛋白的紫外光谱均略有下降，荧光光谱上升，二级结构有序性增加。不同温度同一贮藏时间的比较，可以看出，温度的增加使得光谱的变化更为明显，4℃下，变化微弱，37℃下变化最为明显，紫外吸收，第0天的0.917降至第20天的0.304，荧光光谱，峰发生微弱的偏移，从第0天的467升至第20天的932，二级结构，第0天的无规卷曲结构（25.0%）降至第0天无规卷曲结构（22.4%）。
　　用紫外光谱法从分子水平考察了功能单体与模板蛋白作用摩尔比、以及溶液pH值、交联剂的影响，确定制备凝胶聚合物的最佳条件。S-卵白蛋白100mg、丙烯酰胺500mg和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺50mg溶解于pH=6.5的磷酸缓冲液10mL，超声脱气15min，再加入10％(w/v)过硫酸铵50μL和四甲基乙二胺50μL，室温下静止聚合过夜。生成的凝胶聚合物用80目筛子粒化，成粒的凝胶用SDS(10%)+乙酸(10%)溶液浸泡过夜。以pH=6.5的磷酸缓冲液洗脱，直到光谱检测不到模板分子为止。对聚合物吸附容量的实验表明，在2h内，吸附达到饱和，与空白对照相比效果较好，当S-卵白蛋白与竞争蛋白同时存在时，可以使用该印迹凝胶聚合物选择性的富集模板蛋白。利用红外光谱和电镜考察了聚合物的分子相互作用和形态，结果表明丙烯酰胺与S-卵白蛋白发生作用，生成的聚合物表面积增大，有许多孔洞，有利于对目标蛋白的吸附。当S-卵白蛋白与竞争蛋白同时存在时，可以使用该印迹凝胶聚合物选择性的富集模板蛋白，而与竞争蛋白进行有效的分离。

目录

声明

缩略语表

第一章 绪论

1. 卵白蛋白向S-卵白蛋白的转变

2. 卵白蛋白向S-构型转变过程中的构象变化

3. 卵白蛋白向S-构型的转变与卵白蛋白功能及鲜蛋品质关系

4本课题主要研究内容及研究意义

第二章 不同提取方法对卵白蛋白S-构型转变的影响

1 材料与方法

2.结果与分析

3 结论与讨论

第三章 不同pH溶液对卵白蛋白S-构型转变的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3.结论与讨论

第四章 不同贮藏温度对卵白蛋白S-构型转变的影响

1材料与方法

2.结果与分析

3.结论与讨论

第五章 分子印迹法检测S-卵白蛋白的初步研究

1材料与方法

2结果与分析

3.结论与讨论

第六章 结论

1结论

2创新性

参考文献

致谢

附录I 攻读硕士期间科研情况