S-卵白蛋白与鸡蛋鲜度相关性及其纯化、性质研究

摘要

卵白蛋白是鸡蛋中最丰富的蛋白质组分，占蛋清蛋白总量的54%，为43.0 kDa的单体、球状磷酸糖蛋白，自然卵白蛋白(N-卵白蛋白)在鸡蛋贮存或孵化期间不可逆地转化为热稳定形式(S-卵白蛋白)。S-卵白蛋白为N-日白蛋白的构象异构体，S-构型转化进程中分子特性与理化性质发生相应变化。本课题研究S-卵白蛋白与鸡蛋鲜度的相关性，考察贮藏条件对S-卵白蛋白转化的影响；采用两步超滤技术、聚乙二醇沉淀和阴离子交换层析法分离纯化卵白蛋白；研究S-构型转化对卵白蛋白分子及乳化特性、微观结构的影响；考察白藜芦醇、核黄素、姜黄素等活性小分子与S-卵白蛋白的相互作用，研究超高压处理对S-卵白蛋白结构与功能特性的影响。
　　 探讨以S-卵白蛋白为指标、通过等价蛋龄评价商业鸡蛋鲜度的可行性。分别测定25℃和37℃条件下85枚鲜蛋的S-卵白蛋白含量、蛋黄指数、蛋清pH值和哈夫单位等指标，并进行相关性分析。结果表明，S-卵白蛋白与贮存时间及鸡蛋鲜度评价常用指标之间具有高度相关性。指数回归模型分析建立了等价蛋龄预测模型，将S-卵白蛋白含量转换为等价蛋龄(25℃)，可评价不同条件下贮存鸡蛋的鲜度。研究证实以S-卵白蛋白为指标评价商业鸡蛋鲜度是可行的。
　　 为了探讨贮存条件对鸡蛋清S-卵白蛋白转化的影响，考察了贮存温度、湿度、二氧化碳浓度及涂膜处理等4个影响因素。结果表明，S-卵白蛋白转化与贮存温度呈正相关，高温能加速转化；S-卵白蛋白含量受湿度影响不显著，高湿仅能有限抑制S-卵白蛋白转化；低浓度CO2(2.5%)抑制S-卵白蛋白转化效果不明显，而高浓度Co2(≥5.0%)抑制效果显著；涂膜处理能显著抑制S-卵白蛋白转化，尤其是油溶性涂膜剂、矿物油涂膜处理抑制效果极显著。
　　 基于超滤机理分析了超滤过程中初始料液体积分数、pH值和跨膜压力等参数对膜通量、透过液蛋白质质量浓度的影响。在考察膜通量变化确定超滤时间的基础上，通过超滤试验获得最佳工艺条件：初始料液体积分数6.0%，pH值2.5，跨膜压力0.12 Mpa。超滤产物纯度、回收率较高，卵白蛋白、溶菌酶的纯度分别为85.72%、87.21%，回收率分别为51.36%、62.58%。试验结果表明，两步超滤法可用于鸡蛋清卵白蛋白与溶菌酶的规模化、高效分离。
　　 采用聚乙二醇(PEG)使其它蛋清蛋白质沉淀，然后用阴离子交换层析进一步纯化上清液，获得高纯度卵白蛋白产物。结果表明，15%PEG-8000沉淀可有效地将卵白蛋白与其它蛋清蛋白分离，上清液经Q-Sepharose F F阴离子交换层析纯化，卵白蛋白产物纯度高达94.84%，回收率达71.45%。该法操作简单、周期短，纯度和回收率均理想，可用于工业化大规模生产。
　　 采用DEAE Sepharose C1-6B离子交换纯化N-卵白蛋白、碱性条件下热诱导制备S-卵白蛋白，对S-卵白蛋白分子及乳化特性进行研究，探讨二者之间内在联系。研究S-卵白蛋白转化进程中游离氨基含量、Zeta电位、疏水性、乳化液滴平均粒径(d32)与乳化活性的变化情况。在此基础上对以上因子进行相关性分析，并对S-卵白蛋白的乳化液进行显微镜观察。RP-HPLC显示N-卵白蛋白纯度达98%，差示扫描量热(DSC)分析显示诱导制备了S-卵白蛋白，在S-卵白蛋白转化进程中存在过渡产物(I-卵白蛋白)。S-构型转化使游离氨基含量增加54.69%、Zeta电位降低7.1 mV、乳化液滴平均粒径(d32)减少2.07μm，疏水性提高76.88%，乳化活性提高38.92%，而乳化稳定性减少51.07%。显微镜观察结果表明，S-卵白蛋白易于形成较小的乳化液滴。S-卵白蛋白的转化能有限改善卵白蛋白的乳化活性，却降低乳化稳定性，卵白蛋白的S-构型转化是蛋清蛋白品质劣化的原因之一。
　　 采用圆二色谱、X射线衍射、ANS荧光探针和紫外光谱研究了S-构型转化对卵白蛋白微观结构的影响。结果显示，不同诱导时间处理的卵白蛋白二级结构的α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲之间相互转化，α-螺旋略有减少，β-折叠相应增加，分子有序性提高。S-构型转化后卵白蛋白晶体结构增加，72 h处理后结晶区最大，说明蛋白结构的有序性提高，与CD分析结果一致。卵白蛋白的表面疏水性随诱导时间的延长而增强，72 h处理后达到最大值。S-构型转化使卵白蛋白分子表面具有紫外吸收的芳香氨基酸残基包埋于分子内部，导致最大紫外吸光值随诱导时间的延长而下降。研究表明，卵白蛋白的微观结构变化与S.构型转化有关。
　　 采用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱和紫外光谱研究白藜芦醇、核黄素、姜黄素等3种活性小分子与S-卵白蛋白的相互作用机制。根据Stern-Volmer方程研究了结合作用机理，由热力学参数的计算判断了主要作用力类型，并依据能量转移原理求得了结合距离和能量转移效率。研究表明，3种小分子对S-卵白蛋白内源性荧光产生强烈的猝灭作用，猝灭机理主要为静态猝灭和非辐射能量转移；3种小分子与S-卵白蛋白间结合位点数n≈1、结合距离均小于7 nm；作用力均以氢键和范德华力为主，且为吉布斯自由能降低的自发过程；同步荧光、紫外光谱研究表明3种小分子能够使S-卵白蛋白的构象发生变化。
　　 采用激光拉曼光谱、荧光光谱分析超高压(UHP)处理对S-卵白蛋白构象的影响，并考察其对溶解性、乳化性和起泡性等功能特性的影响。结果表明，经UHP处理后S-卵白蛋白的分子量分布没有明显变化。随着压力的增加，无规卷曲含量逐渐增加，二硫键构象变化使得蛋白稳定性降低，酪氨酸残基包埋于侧链中，紧密折叠结构得以舒展。经100 Mpa处理后S-卵白蛋白的荧光强度略有增强，此后急剧下降，无峰位位移现象，说明UHP引起蛋白分子构象变化。S-卵白蛋白的溶解性、乳化能力及起泡能力等功能特性均随压力增加而明显改善，以300 Mpa处理较为理想，此后压力增加至500 Mpa时反而下降。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 卵白蛋白

1.1 结构

1.2 纯化

1.3 改性

2 S-卵白蛋白的转化

2.1 转化途径

2.2 转化机制

2.3 影响因素

3 S-卵白蛋白的特性

3.1 结构特性

3.2 热稳定性

3.3 功能特性

3.4 其他特性

4 本课题主要研究内容及研究意义

4.1 主要研究内容

4.2 技术路线

4.3 研究意义

第二章 S-卵白蛋白与鸡蛋鲜度相关性

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 试验设计

1.4 测定方法

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 S-卵白蛋白转化动态

2.2 相关性分析

2.3 等价蛋龄预测模型

3 本章小结

第三章 贮存条件对蛋清S-卵白蛋白转化的影响

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 试验设计

1.4 涂膜处理

1.5 S-卵白蛋白含量测定

1.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 温度对S-卵白蛋白转化的影响

2.2 湿度对S-卵白蛋白转化的影响

2.3 CO2浓度对S-卵白蛋白转化的影响

2.4 涂膜处理对S-卵白蛋白转化的影响

3 本章小结

第四章 两步超滤法分离鸡蛋清卵白蛋白

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 分离方法

1.4 测定方法

1.5 试验设计

2 结果与分析

2.1 超滤时间

2.2 初始料液体积分数

2.3 pH值

2.4 跨膜压力

2.5 产物纯度

3 本章小结

第五章 聚乙二醇沉淀和阴离子交换层析法纯化卵白蛋白

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 聚乙二醇沉淀

1.3 从上清液s中纯化卵白蛋白

1.4 卵白蛋白纯度测定

1.5 回收率计算

2 结果与分析

2.1 聚乙二醇沉淀

2.2 上清液S纯化卵白蛋白

2.3 卵白蛋白产物纯度

2.4 卵白蛋白得率

3 本章小结

第六章 S-构型转化对卵白蛋白分子与乳化特性的影响

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 N-卵白蛋白纯化

1.4 S-卵白蛋白制备

1.5 SDS-PAGE电泳

1.6 反相高效液相色谱(RP-HPLC)

1.7 测定方法

1.8 分子特性与乳化活性相关性分析

1.9 乳化液微观结构观察

2 结果与分析

2.1 N-卵白蛋白的纯度测定

2.2 卵白蛋白的DSC分析

2.3 S-构型转化对疏水性和Zeta电位的影响

2.4.S-构型转化对游离氨基含量和乳化液平均粒径的影响

2.5 S-构型转化对乳化活性及稳定性的影响

2.6 相关性分析

2.7 乳化液微观结构观察

3 本章小结

第七章 S-构型转化对卵白蛋白微观结构的影响

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 卵白蛋白的制备

1.3 光谱测定

2 结果与分析

2.1 CD光谱

2.2 X射线衍射

2.3 荧光光谱

2.4 紫外光谱

3 本章小结

第八章 S-卵白蛋白与活性小分子相互作用的光谱研究

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 荧光猝灭机理

2.2 温度的影响

2.3 pH的影响

2.4 结合常数及结合位点数

2.5 作用力类型的确定

2.6 结合距离的计算

2.7 同步荧光光谱

2.8 紫外吸收光谱

3 本章小结

第九章 超高压对S-卵白蛋白构象与功能特性的影响

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 超高压处理

1.4 SDS-PAGE电泳

1.5 光谱测定

1.6 功能特性测定

2 结果与分析

2.1 UHP对蛋白分子量的影响

2.2 拉曼光谱分析UHP对蛋白构象的影响

2.3 荧光光谱分析UHP对蛋白构象的影响

2.4 UHP对功能特性的影响

3 本章小结

第十章 结论与展望

1 结论

2 展望

3 创新性

参考文献

致谢

附录Ⅰ个人简历

附录Ⅱ 攻读博士期间科研情况