蔷薇科植物上两种未知病毒的基因组克隆及其分子特性分析

摘要

蔷薇科植物是重要的园艺作物，受病毒危害后造成严重的经济损失。明确其病毒种类是制定防治策略的基础，具有重要的经济意义。近年来我们在武汉地区的玫瑰和桃上发现了两种新的疑似病毒病害，对寄主具有显著的危害性。近年来，随着深度测序技术的快速发展，人们逐渐将该项技术运用于病毒的鉴定，可以高通量分析寄主内的病毒种类，并可以促进对新病毒的发现。本研究通过采用小RNA(smallRNA，sRNA)深度测序技术，鉴定了两种蔷薇科植物内侵染的病毒，并发现了两个新病毒种。主要研究内容包括：
　　⑴表现丛簇症状的野蔷薇植株被4种病毒复合侵染。收集表现小叶莲座丛生症状的野蔷薇样品，利用Illumina高通量测序平台进行测序，通过生物信息学分析样品中病毒的siRNA种类，深度测序的结果表明野蔷薇样品中共携带四种病毒。三种已报道的病毒:黑莓褪绿环斑病毒(Blackberry chloroticringspot virus，BCRV)、李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)和一种未知病毒，暂时命名为“玫瑰叶丛簇伴随相关病毒”(rose leaf rosette associated virus，RLRaV)。样品中已报道病毒可通过深度测序获得的siRNAs组装获得全长基因组序列，并且与NCBI数据库报道的病毒基因组核苷酸序列相似性很高，均在96％以上。其中ASGV为97％，BCRV为96％-97％，PNRSV为97％-98％。本研究首次报道了长线性病毒属（Closterovirus）和发状病毒属（Capillovirus）病毒可以侵染野蔷薇。
　　⑵RLRaV的基因组克隆、基因组结构分析及与野蔷薇丛簇症状间的相关性分析。依据siRNA拼接获得的核苷酸序列设计引物，采用重叠延伸RT-PCR扩增覆盖整个基因组的片段，分别获得5'和3'末端序列后，我们确定了RLRaV的全长核苷酸序列(登录号为KJ748003)。RLRaV基因组大小为17653个核苷酸，属于长线性病毒科（Closteroviridae）长线性病毒属（Closterovirus），包含13个开放阅读框(Openreading frame，ORF)。除ORF1和五联体基因块区外(QGB)，其它大部分基因编码的蛋白与已知的病毒蛋白没有明显相似之处，但可检测到与一些真菌或细菌的未知蛋白具有一定相似性，并发现该病毒多种蛋白(L2，Mt，HSP70h和CPh)的保守区域存在插入和缺失现象。基于基因组结构分析，推测该病毒在进化程度上较该属其它成员高级。根据田间20多份显症和不显症样品的检测分析发现，RLRaV的侵染率较其它三种病毒侵染率高，与野蔷薇的丛簇症状更加密切相关，因此推测RLRaV是引起野蔷薇叶丛簇病害的主要病原物。
　　⑶表现果实开裂的桃植株被3种病毒和2种类病毒复合侵染。利用Illumina高通量测序平台，对表现果实开裂症状的桃植株样品进行测序，通过生物信息学分析样品中病毒的vsRNA种类，深度测序结果表明桃植株样品携带两种类病毒:啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid, HSVd)、桃潜隐花叶类病毒(Peachlatent mosaic viroid, PLMVd)和两种已报道病毒:苹果褪绿叶斑病毒(Apple ChloroticLeafspot Virus，ACLSV)和李树皮坏死环斑茎痘伴随相关病毒(Plum bark necrosisstem pitting-associated virus，PBNSPaV)及一种未知病毒，暂时命名为“桃裂果伴随相关病毒”（Peach cracking fruit associated virus，PCFaV）。
　　⑷PCFaV的基因组克隆及基因结构分析。基于siRNA拼接获得的核苷酸序列设计引物，采用重叠延伸RT-PCR扩增、克隆测序获得了PCFaV全长核苷酸序列。系统进化分析表明，PCFaV与豇豆花叶病毒科（Comoviridea）蚕豆萎蔫病毒属（Fabavirus）成员聚为一组，但与同属病毒的遗传距离较远。PCFaV病毒基因组由两条单链的RNA分子组成，RNA1和RNA2核苷酸序列分别为6309 nt和3837nt。其中，RNA1编码一个分子量约217kDa的多聚蛋白，经蛋白酶切割产生5个多肽，分别为蛋白酶辅助因子Co-pro，NTP结合域Hel，基因链接蛋白VPg，蛋白酶Pro和复制酶RdRp; RNA2编码一个分子量约110kDa的多聚蛋白，被蛋白酶切割为3个功能肽，分别为与病毒运动有关的蛋白MP，复制相关的大、小外壳蛋白LCP和SCP。各基因编码蛋白与已知病毒蛋白的相似性较低，氨基酸相似性小于51％。首次报道了蚕豆萎蔫病毒属（Fabavirus）病毒侵染核果类果树的现象，其与症状间的相关性有待进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 深度测序技术在病毒鉴定上的应用

1．2 玫瑰主要病毒病害研究进展

1．3 桃树主要病毒病害研究进展

1．4 Closterovirus属病毒的生物学和分子特性

1．4．1 分类地位

1．4．2 生物学特征

1．4．3 基因组结构

1．5 Fabavirus属病毒的生物学和分子特性

1．5．1 分类地位

1．5．2 生物学特征

1．5．3 基因组结构

1．6 研究目的和意义

第二章 野蔷薇上一种未知病毒的基因组克隆及分子特性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 样品准备和深度测序

2．1．2 sRNA序列的分析和组装

2．1．3 利用Sanger测序验证和完成病毒的基因组序列测定

2．1．4 序列分析

2．1．5 病毒的RT-PCR检测

2．3 结果与分析

2．3．1 深度测序的原始数据分析

2．3．2 深度测序样品中所有病毒的种类分析

2．3．3 RLRaV全基因组核苷酸序列的测定

2．3．4 RLRaV RNA的基因组结构

2．3．5 来源于RLRaV的sRNAs的分析

2．3．6 WRLRD侵染的野蔷薇上共侵染病毒的鉴定

2．3．7 共侵染病毒的RT-PCR鉴定

2．4 讨论

第三章 桃上一种未知病毒的基因组克隆及分子特性分析

3．1 材料与方法

3．1．1 样品准备和深度测序

3．1．2 sRNA序列的分析和组装

3．1．3 利用Sanger测序验证和完成病毒的基因组序列测定

3．1．4 序列分析

3．1．5 病毒的RT-PCR检测

3．2 结果与分析

3．2．1 深度测序的原始数据分析

3．2．2 深度测序样品中所有病毒和类病毒的种类分析

3．2．3 PCFaV全基因组核苷酸序列测定

3．2．4 PCFaV的基因组结构

3．2．5 来源于PCFaV的sRNAs的分析

3．3 讨论

第四章 全文结论与展望

参考文献

附录

研究生期间已发表文章

致谢