光谱法测定转基因牛序列特异性核酸片段的研究

摘要

随着转基因产品(GMO)商品化发展进程的推进，涉及GMO的安全评价和安全管理引起了人们的高度关注。在安全评价中，首要任务就是对转基因样品进行检测。确定待测样品中是否含有转基因成分，主要通过检测插入的外源DNA和基于转基因生物中特定基因表达产物（新型蛋白质），其中基于DNA水平的检测方法因其具有快速准确的优点而受到广泛的应用。但是，对于长链DNA片段的特异性检测仍然存在挑战。基于荧光能量共振转移(FRET)的荧光探针因具有高特异性而获得研究者的较多关注。近年来，具有独特物理和化学性质的金纳米粒子(AuNPs)也经常被用于构建新颖的化学和生化传感器。本文以探针杂交为基础，结合荧光技术和纳米分析技术，构建了荧光染料探针和纳米金光学分子探针，并以此建立了三种用于检测转基因牛序列特异性长链核酸片段的新方法。本论文的主要内容及研究结果如下:
　　1.利用长链oligos制备了FITC-MB和TR-MB两种荧光探针，基于与目标物杂交导致两次FRET的过程，构建了一种简便快速、特异性好、准确度高的检测转基因牛序列特异性长链核酸片段的方法。
　　2.利用发夹结构的巯基长链DNA功能化修饰纳米金，制备了特异性识别目标物的纳米金比色探针，以捕获探针、显色探针和目标物的三组分“三明治杂交”为基础构建了比色传感器，实现了对转基因牛PCR产物的可视化检测。
　　3.利用发夹结构的巯基长链DNA功能化修饰纳米金，制备了特异性识别目标物的纳米金光学探针，采用共振光散射技术，根据纳米金探针在目标物存在时聚集程度的变化，建立了一种操作简单、成本经济、灵敏度高的检测转基因牛序列特异性长链核酸片段的方法。
　　本论文研究开发的三种方法，实现了对序列特异性长链DNA片段的特异性检测，满足了不同检测环境的需要，为GMO的检测提供了新思路。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．2 序列特异性核酸片段检测方法研究进展

1．2．1 核酸片段的标记

1．2．2 纳米金光学生物传感器

1．3 分子信标研究进展

1．3．1 分子信标的概述

1．3．2 MB的应用

1．4 本研究的目的和意义

第二章 基于双FRET的MBs探针用于转基因牛序列特异性核酸片段的检测

2．1 前言

2．2 试剂及主要仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 分子信标的制备及验证

2．3．2 检测条件的优化

2．3．3 检测体系的灵敏度

2．3．4 检测体系的特异性

2．4 实验结果与分析

2．4．1 MB与目标物结合性能研究

2．4．2 检测条件的优化

2．4．3 检测体系的灵敏度

2．4．4 检测体系的特异性

2．5 本章小结

第三章 纳米金分子探针用于转基因牛序列特异性核酸片段的可视化检测

3．1 前言

3．2 试剂及主要仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 主要实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 金纳米粒子的制备

3．3．2 纳米金比色探针的制备

3．3．3 纳米金传感器的制备

3．3．4 单链目标物的检测

3．3．5 检测条件的优化

3．3．6 转基因牛PCR产物检测过程

3．4 实验结果与分析

3．4．1 纳米金比色探针的合成与表征

3．4．2 传感器性能表征

3．4．3 检测条件的优化

3．4．4 比色探针灵敏度

3．4．5 转基因牛PCR产物的检测

3．5 本章小结

第四章 基于纳米金分子探针的RLS对转基因牛序列特异性核酸片段的检测

4．1 前言

4．2 试剂及主要仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 主要实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 金纳米粒子的制备

4．3．2 纳米金探针的制备

4．3．3 检测体系的灵敏度

4．3．4 检测系统的特异性

4．4 实验结果与分析

4．4．1 纳米金探针的合成与表征

4．4．2 检测体系的灵敏度

4．4．3 检测体系的特异性

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

致谢