抑制素基因疫苗免疫杂交水牛的方法学和安全性研究

摘要

前期研究表明，抑制素基因免疫通过中和内源性抑制素，可促进FSH的分泌，进而促进卵泡发育和排卵，提高动物繁殖性能。本实验室构建了以减毒沙门氏菌为载体的抑制素基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)，其制备简便，便于扩大生产。在免疫小鼠后，提高了其大卵泡的数量和产仔数。且该疫苗没有抗生素抗性基因，不会造成抗生素危害，有利于在大动物上的推广应用。但在不同的物种中，抑制素基因免疫的效果也受到免疫接种途径、免疫剂量和免疫次数等因素的影响。且在临床应用和环境释放的安全性方面，特别是在水牛临床试验的安全性方面尚未研究。因此，本研究分别分析了抑制素基因疫苗肌注免疫的剂量和鼻饲免疫的天数，对杂交水牛在繁殖季节的卵泡发育、发情排卵和受胎的影响。挑选出免疫效果最佳的免疫剂量和天数，再比较以上两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育、发情排卵和受胎的影响。分析抑制素基因疫苗在繁殖季节和非繁殖季节应用于杂交水牛的促卵泡生长发育和排卵的效果，并从水牛临床应用和环境释放角度，分析抑制素基因疫苗的安全性，为促进抑制素基因疫苗的推广应用和优化提高杂交水牛繁殖性能的新技术奠定了基础，主要研究内容与结果如下:
　　1.抑制素基因疫苗肌肉注射剂量对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响
　　选择158头杂交水牛分为四组，其中免疫组T1(n=41)、T2(n=37)和T3(n=37)分别注射1010、109和108CFU/ml的抑制素重组菌C501(pVAX-asd-IS)，10ml/头，对照组(n=43)注射PBS，初次免疫为第0天，加强免疫在第14天。所有牛只在第28天肌肉注射孕马血清促性腺激素(PMSG)1000IU，第30天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg，48小时后注射200μg促性腺激素释放激素(GnRH)。进行B超检测，记录卵泡发育和排卵情况。结果显示肌肉注射免疫抑制素重组菌C501(pVAX-asd-IS)后，各免疫组杂交水牛均能产生抗抑制素IgG抗体，以1010CFU/ml剂量组的抗体水平最高。1010CFU/ml剂量组的大卵泡（≥10mm）和排卵卵泡的数量与直径显著(P＜0.05)高于对照组，且优势卵泡的生长速度显著高于108CFU/ml剂量和对照组(P＜0.05)。抗体阳性组的发情、排卵和受胎率显著高于抗体阴性组。以上结果说明以1010CFU/ml的抑制素重组基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)肌肉注射免疫杂交水牛，能显著促进卵泡的生长发育，促进杂交水牛的发情和排卵，提高其繁殖性能。
　　2.抑制素基因疫苗鼻饲免疫天数对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响
　　选择134头杂交水牛分为4组:免疫5天组(n=34)、免疫3天组(n=35)和免疫1天组(n=31)分别用1010CFU/ml C501(pVAX-asd-IS)疫苗连续鼻饲免疫5、3和1天，10ml/头，每天喷鼻两次。对照组(n=34)使用10ml PBS鼻饲免疫5天。所有牛只初次免疫为第0天，加强免疫在第14天。且在第28天注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg，第35天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg，第37天再次注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg，在之后的18和24小时进行人工授精。B超检测记录卵泡发育和排卵情况。结果显示在初次免疫后的14和28天，鼻饲免疫C501(pVAX-asd-IS)能引起显著的免疫反应，免疫5天组的抗抑制素IgG抗体水平显著高于免疫1天组(P＜0.01）。且加强免疫后抗体水平有上升的趋势。在二次注射GnRH后，免疫5天组的优势卵泡增长速度显著快于对照组和免疫1天组，且免疫5天组的大卵泡(≥10mm)和排卵卵泡的数量和直径高于其他各组，使得免疫5天组有较高的发情、排卵和受胎率。结果表明，以抑制素重组基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)鼻饲免疫5天，能显著促进水牛的卵泡生长和发情排卵，与Ovsynch-TAI相结合，可提高杂交水牛在繁殖季节的受胎率。
　　3.抑制素基因疫苗两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育和发情排卵及受胎的影响
　　选取81头经产杂交水牛随机分为三组:肌肉注射组(n=29)肌注1010CFU/ml抑制素重组菌苗C501(pVAX-asd-IS)，10ml/头，每天一次，免疫3天;鼻饲免疫组(n=27)鼻饲1010CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS），10ml/头，每天两次，免疫5天;对照组C(n=25)每头肌肉注射10ml PBS，每天一次，共注射5天。初次免疫为第0天，加强免疫在第14天。全体牛只在第28天肌肉注射孕马血清促性腺激素(PMSG)1000IU，第30天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg，48小时后注射200μg促性腺激素释放激素(GnRH)。B超检测记录卵泡发育和排卵情况。研究结果显示以肌肉注射和鼻饲免疫杂交水牛，均能诱导机体产生抗抑制素抗体，且两种免疫方式的抗体水平差异不显著。但肌肉注射组的抗体阳性率高于鼻饲免疫组(82.8％vs.74.1％)。两种免疫方式均能增加大卵泡和排卵卵泡的数量和直径，以肌肉注射的效果较强。在非繁殖季节，肌肉注射组杂交水牛的发情、排卵和受胎率均高于鼻饲免疫组和对照组，且与繁殖季节的发情、排卵和受胎率相当。抗体阳性牛的受胎率也显著高于抗体阴性牛(56.8％ vs.27.0％;P＜0.01)。结果表明，以肌肉注射和鼻饲免疫抑制素基因疫苗C501(pVAX-asd-IS)均能诱导良好的免疫反应，但以肌肉注射的免疫效果更优，能显著增加成熟卵泡的数量和直径，提高杂交水牛在非繁殖季节的发情，排卵和受胎率。
　　4.抑制素基因疫苗的生物安全性评价
　　选用81头经产杂交水牛随机分为三组:肌肉注射组(n=29)肌注1010CFU/ml抑制素重组菌苗C501（pVAX-asd-IS），10ml/头，每天一次，免疫3天;鼻饲免疫组(n=27)鼻饲1010CFU/ml抑制素重组菌苗C501(pVAX-asd-IS)，10ml/头，每天两次，免疫5天;对照组C(n=25)每头肌肉注射10ml PBS，每天一次，共注射5天。初次免疫为第0天，加强免疫在第14天。对免疫后杂交水牛的体温和心率进行监测，并对粪便、水和土壤样本进行采集，用PCR方法检测invA基因。结果表明各组杂交水牛在免疫后未出现临床症状，其体温和心率正常。在粪便、水和土壤样本中均未检测到invA目的基因。说明以肌肉注射和鼻饲免疫抑制素重组菌苗，在杂交水牛上的运用是安全的，且重组菌苗不会通过牛体向外界传播，对环境不会产生不利影响。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1 抑制素基因免疫研究进展

1．1 抑制素常规免疫

1．2 抑制素基因免疫

1．3 抑制素基因疫苗的安全性

2 水牛同期发情研究进展

2．1 水牛发情周期的生理学特性

2．2 同期发情技术在水牛上的应用

3 研究的目的与意义

第二章 抑制素基因疫苗肌肉注射的剂量对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 各免疫剂量组的抗抑制素IgG抗体水平

2．2 各免疫剂量组杂交水牛的发情、排卵及受胎率

2．3 各免疫剂量组杂交水牛的大卵泡数量和直径

2．4 各免疫剂量组杂交水牛的排卵反应

2．5 各免疫剂量组优势卵泡直径的生长速度

3 讨论

4 结论

第三章 抑制素基因疫苗鼻饲免疫的天数对杂交水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响

引言

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 各免疫天数组的抗抑制素IgG抗体水平

2．2 各免疫天数组杂交水牛发情，排卵和受胎的比例

2．3 各免疫天数组的大卵泡的数量和直径及排卵反应

2．4 各免疫天数组优势卵泡直径的生长速度

3 讨论

4 结论

第四章 抑制素基因疫苗两种免疫途径对杂交水牛在非繁殖季节的卵泡发育和发情排卵及受胎的影响

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 不同途径免疫的抗抑制素IgG抗体水平

2．2 不同途径免疫杂交水牛的发情、排卵及受胎比例

2．3 不同途径免疫杂交水牛的大卵泡数量和直径

2．4 不同途径免疫杂交水牛的排卵反应

2．5 繁殖季节与非繁殖季节杂交水牛的繁殖性状

3 讨论

4 结论

第五章 抑制素基因疫苗的生物安全性评价

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 免疫后杂交水牛临床反应的检测

2．2 疫苗菌株在外界环境中的存活情况检测

3 讨论

4 结论

全文总结

创新与不足

参考文献

发表的论文

致谢