重组腺病毒介导的4-1BBIg基因治疗延长小鼠同种心脏移植物存活的实验研究

摘要

移植排斥反应的实质是同种反应性T细胞识别同种抗原后发生的细胞免疫应答，其机制为：移植术后，供、受者来源的DC可迁移至受者外周免疫器官，通过直接或间接识别途径，向受者同种反应性T细胞提呈同种抗原，并使之激活，进而诱导针对同种抗原的免疫应答。因此，通过基因治疗干预DC与同种反应性T细胞间的相互作用，有可能成为防治移植排斥反应的有效策略。迄今，多数干预策略的原理是阻断同种免疫应答中DC和T细胞间的共刺激途径，使T细胞因缺乏共刺激信号而失能(anergy)或凋亡。 参与T细胞活化的共刺激分子主要包括两类，即免疫球蛋白超家族(IgSF)成员和肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员。研究显示，单独由IgSF共刺激分子(如CD28/B7)启动的信号，并不能持续激活T细胞，也不能形成记忆性T细胞，还需TNFRSF共刺激分子参与。属于TNFRSF的T细胞共刺激分子包括OX40、4-1BB、CD27、CD30和HVEM，均属Ⅰ型跨膜蛋白。其中，CD27和HVEM组成性表达于naYveT细胞表面；OX40、4-1BB和CD30在T细胞识别抗原数小时后诱导性表达。 4-1BB于1989年在筛选活化T细胞cDNA文库时被发现，其并不组成性表达于静止T细胞表面，而仅表达于活化CD4+T、CD8+T和NK细胞等表面。最新研究表明，4-1BB也可表达于DC、单核细胞和中性粒细胞表面。4-1BB的配体表达于活化的APC(如DC、B细胞和单核/巨噬细胞)表面。根据4-1BB与4-1BBL所分别表达的细胞类型，提示4-1BB可能参与固有免疫和适应性免疫应答的多个阶段。近期研究显示，与CD40相同，4-1BB也是参与DC活化的分子之一。通过启动4-1BB信号途径，可诱导DC产生IL-6和IL-12等，同时上调共刺激分子B7-1和B7-2表达。与CD40/CD40L信号途径的不同之处是，CD40信号的启动有赖于活化T细胞提供配体(CD40L)，而启动DC表面4-1BB信号转导的配体可能来源于邻近的APC或DC自身。因此，4-1BB的生物学功能不仅限于参与T细胞活化。研究发现：B7/CD28共刺激信号主要在T细胞活化的前期起作用，可促进T细胞增殖并维持其短期存活；4-1BB/4-1BBL信号通路主要在免疫应答后期被启动，可维持T细胞活化，并是CD8+T细胞存活和记忆性细胞形成的必需条件。免疫应答过程中，尤其在CD28分子表达缺陷或功能障碍的情况下，4-1BB/4-1BBL通路可能在提供共刺激信号中发挥极为重要的作用。 结论 1.借助大肠杆菌BJ5183同源重组及AdEasy载体系统，成功制备携带小鼠4-1BB胞外段和人IgGFc融合基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad4-1BBlg，国内外均未见相关报道。 2.在成功制备Ad4-1BBlg重组腺病毒的基础上，初步探讨其干预移植排斥反应的作用及机制。结果发现：Ad4-1BBlg可抑制同种反应性T细胞增殖和细胞因子分泌、抑制CD8+的IFN-γ+细胞产生、抑制单个核细胞浸润移植物，并有效延长小鼠同种移植心脏存活时间。本课题研究成果可望为干预移植排斥反应提供新策略。

目录

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主要缩略词表

前言

第一部分小鼠4-1BB胞外段及人IgG Fc基因的克隆及真核表达质粒的构建与鉴定

第二部分应用AdEasy系统在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组获得携带4-1BBIg的复制缺陷型重组腺病毒

第三部分重组腺病毒Ad4-1BBIg鉴定及4-1BBIg融合蛋白的表达、纯化和体外生物学效应

第四部分Ad4-1BBIg重组腺病毒基因治疗延长异基因小鼠心脏移植物存活时间及其机制

讨论

结论

参考文献

综述肿瘤坏死因子受体超家族：效应T细胞发挥免疫功能的关键分子

博士研究生期间发表的文章

致谢