欧文氏菌类胡萝卜素合成关键酶基因CrtB和CrtI遗传转化改良小麦营养品质的研究

摘要

小麦种子中类胡萝卜素的含量是决定小麦营养品质和影响其最终用途的关键因素之一。而普通小麦的种子只积累少量的类胡萝卜素和微量的维生素A原成分。由于对小麦类胡萝卜素生物合成还知之甚少，通过基因工程提高小麦类胡萝卜素含量的相关育种研究报道非常有限。一方面是因为传统的小麦品质改良主要侧重于小麦的加工品质研究，另一方面是由于小麦庞大而复杂的基因组，使得分离小麦类胡萝卜素合成酶基因十分困难。同时，小麦转基因技术瓶颈进一步制约了小麦类胡萝卜素代谢工程的研究进展。
　　随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，类胡萝卜素的营养保健功能逐渐被关注。育种学家尝试通过基因工程的手段提高作物中的类胡萝卜素含量，并相继在水稻，油菜，玉米和土豆等经济作物中取得了成功。小麦作为人类最重要的主食作物之一，提高小麦种子中类胡萝卜素的含量不仅可以提高小麦的营养价值和经济价值，还有益于人类的健康。因此，为了提高小麦种子中的类胡萝卜素含量，同时揭示小麦类胡萝卜素合成通路的调节机制，本研究在小麦品种Bobwhite中单独及共同转化了欧文氏菌八氢番茄红素合成酶基因CrtB和欧文氏菌类胡萝卜素脱氢酶基因CrtI。经过草甘膦培养基筛选和PCR鉴定，获得了三个转基因组合（CrtB，CrtI，CrtB和CrtI）的后代阳性株系。HPLC分析结果显示，单独转化CrtB或CrtI基因并不能显著提高转基因后代总的类胡萝卜素含量。与野生型Bobwhite相比，共同转化CrtB和CrtI基因的转基因后代种子呈现更深的黄/红色。总的类胡萝卜素提高8倍左右，达到4.76μg g-1。β-胡萝卜素提高了65倍，达到3.21μg g-1。维生素A原含量（α-胡萝卜素，β-胡萝卜素和β-玉米黄质）的含量最高提高了76倍，达到3.82μg g-1。qPCR分析结果显示，转基因株系中高维生素A含量积累的性状是外源基因与小麦內源类胡萝卜素合成基因协同作用的结果，同时证明了在小麦类胡萝卜素合成通路中存在代谢的反馈调节机制。本研究结果还证实了小麦內源LCYs和HYDs基因在维生素A原类胡萝卜素合成中具有的重要作用，并揭示LCYE和LCYB是决定小麦类胡萝卜素合成通路下游类胡萝卜素合成的关键酶。
　　通过在小麦幼胚中共转化CrtB和CrtI基因不仅获得了迄今为止积累维生素A原成分最高的转基因小麦，还证明在小麦类胡萝卜素代谢调控过程中，需要对多个类胡萝卜素合成关键酶基因同时进行调控，才能获得类胡萝卜素显著的积累。本文的研究结果不仅有助于深入了解小麦类胡萝卜素调控机制，而且为选育富含类胡萝卜素的转基因小麦新品种提供了分子生物学依据。

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1 绪 论

1.1 类胡萝卜素概述

1.2 植物类胡萝卜素生物合成及调控

1.3 类胡萝卜素生产的研究进展

1.4 类胡萝卜素生物检测技术的研究进展

1.5 类胡萝卜素基因工程的研究进展

1.6 类胡萝卜素与小麦营养品质

1.7 本文研究目的和研究内容

2 欧文氏菌八氢番茄红素合成酶基因CrtB和欧文氏菌胡萝卜素

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 遗传转化细菌类胡萝卜素合成相关基因CrtI和CrtB对小麦种

3.1 实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 转基因小麦中外源CrtI、CrtB基因及內源小麦类胡萝卜素合

4.1 实验材料、仪器及试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

5 全文总结与展望

5.1 主要研究结果

5.2 本文的特色与创新

5.3 课题展望

致谢

参考文献

附录1 攻读博士学位期间发表的论文

附录2 主要符号与缩略词表

附录3 本论文中使用的质粒图谱

附录4 本论文中使用的基因序列

附录5 本论文中使用的培养基母液配方