欧文氏菌类胡萝卜素合成酶CrtB和CrtI的原核表达与多克隆抗体制备

摘要

类胡萝卜素是衡量小麦营养品质的重要指标。为提高小麦中的类胡萝卜素含量，本实验室将欧文氏菌类胡萝卜素脱氢酶基因(CrtI)和八氢番茄红素合成酶基因(CrtB)导入到了小麦模式品种Bobwhite中，并成功获得了这两个基因单转和共转的转基因小麦。通过对转基因后代的分析发现，导入这两个基因的单转和共转的转基因株系都导致了小麦胚乳中类胡萝卜素含量的增加。在不同的转基因株系中，CrtB和CrtI在转录水平上的表达情况已经进行了详细的检测分析。
　　为了进一步检测这两个基因在转基因小麦中翻译水平上的变化情况与小麦类胡萝卜素含量之间的关系，本研究分别构建了CrtB和CrtI的原核表达载体pET32-CrtI和pET32-CrtB，并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。通过IPTG诱导表达，分别得到了两个基因的融合蛋白 His-Trx-s-CrtI和 His-Trx-s-CrtB。将融合蛋白进行纯化、免疫家兔，成功获得了抗 CrtB和 CrtI蛋白的多克隆抗体。利用 western-blot技术分别对CrtB和CrtI在转基因小麦后代的表达情况进行了检测，结果表明，转基因阳性植株后代均不同程度地表达了外源基因蛋白CrtB和CrtI。本研究所获得的抗CrtB和CrtI的多克隆抗体可用于今后“黄金小麦”的分析研究。

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1 绪 论

1.1 引言

1.2 类胡萝卜素的简介

1.3 原核表达系统的背景资料

1.4 本研究的目的及意义

1.5 本研究的技术路线

2 实验器材

2.1 实验仪器

2.2 菌株与质粒

2.3 实验材料

2.4 实验试剂

2.5 培养基

2.6 溶液及缓冲液

3 实验方法及结果

3.1 欧文氏菌类胡萝卜素合成基因CrtI 和CrtB原核表达载体构建

3.2 His-Trx-S-CrtI和His-Trx-S-CrtB融合蛋白的诱导、提取与纯化

3.3 His-Trx-S-CrtI和His-Trx-S-CrtB融合蛋白多克隆抗体制备与检测

4 讨 论

5 总结与展望

5.1 全文总结

5.2 本文创新点

5.3 课题展望

致谢

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 质粒图谱

附录3 缩略语表

附录4 CrtB 及CrtI基因序列