左归丸对庆大霉素诱导耳肾损伤大鼠模型JNK/c-Jun通路的影响及机制

摘要

目的:探讨左归丸对庆大霉素诱导耳肾损伤大鼠模型JNK通路的影响及机制。
　　 方法:
　　 (1)将12只SPF级雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、庆大霉素组。每组6只。空白对照组腹腔注射生理盐水2.5ml·kg-1·d-1，庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素100mg· kg-1· d-1。每日根据体重调整给药剂量。2组大鼠连续给药10d。分别在给药前和给药后检测大鼠听力ABR阈值、尿NAG酶值，在实验结束取耳蜗和肾脏标本进行HE染色，在光镜下观察耳蜗和肾脏病理变化。
　　 (2)将18只SPF级Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分为3组:空白对照组，模型组和左归丸组。每组6只。空白对照组腹腔注射生理盐水2.5ml·kg-1·d-1，模型组腹腔注射硫酸庆大霉素100mg· kg-1· d-1，左归丸组腹腔注射硫酸庆大霉素100mg· kg-1· d-1和灌胃左归丸水溶液10g·kg-1·d-1。每日根据体重调整给药剂量。3组大鼠连续给药10d。分别在给药前和给药后检测大鼠听力ABR阈值、尿NAG酶值、大鼠体重变化。实验结束后，测量大鼠肾脏指数，留取血液检测Scr、BUN。留取耳蜗和肾脏标本光镜和电镜下观察病理变化。
　　 (3)将72只SPF级Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分为4组:空白对照组，模型组、SP600125组和左归丸组。每组18只。空白对照组腹腔注射生理盐水2.5ml·kg-1· d-1;模型组腹腔注射硫酸庆大霉素100mg·kg-1·d-1; SP600125组左侧腹腔注射硫酸庆大霉素100mg·kg-1·d-1，2h后右侧腹腔注射SP60012515mg·kg-1·d-1;左归丸组腹腔注射硫酸庆大霉素100mg· kg-1· d-1和灌胃左归丸水溶液10g·kg-1·d-1。每日根据体重调整给药剂量。4组大鼠连续给药10d。实验结束后，留取耳蜗和肾脏标本，以免疫组化方法、免疫印迹杂交方法、实时定量PCR方法检测JNK、p-JNK、c-Jun的表达和蛋白、基因的含量。
　　 结果:
　　 (1)庆大霉素组大鼠腹腔注射100mg·kg-1·d-1×10d后，听力ABR阈值和尿NAG酶值明显升高，与空白对照组相比，具有统计学差异（P＜0.01）。大鼠耳蜗、肾脏病理形态比较:空白对照组螺旋器毛细胞完整无缺失，排列整齐;肾脏小管、间质无特殊改变。而庆大霉素组螺旋器毛细胞出现丢失、变性、排列不规则;肾小管出现炎性细胞浸润，并出现细胞肿胀、变性。
　　 (2)3组大鼠ABR阈值、尿NAG酶、血Scr与BUN、肾脏指数结果:与空白对照组相比，模型组ABR阈值、尿NAG酶、血Scr与BUN、肾脏指数值明显升高，具有统计学差异（P＜0.01）;与模型组相比，左归丸组ABR阈值、尿NAG酶、血Scr与BUN、肾脏指数值明显下降，具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。大鼠体重结果:与空白组相比，模型组大鼠体重数值明显降低，具有统计学差异（P＜0.01）;与模型组相比，左归丸组大鼠体重数值得到升高，具有统计学差异（P＜0.05）。耳蜗、肾脏HE染色病理结果:空白对照组耳蜗螺旋器毛细胞无缺失，排列整齐;肾脏小管、间质无特殊改变。而模型组耳蜗螺旋器毛细胞出现核固缩、核破裂，毛细胞丢失严重;肾脏小管上皮细胞出现肿胀、变性和少量坏死。左归丸组耳蜗毛细胞有少量丢失，排列尚可;肾脏小管上皮细胞出现轻微肿胀、变性。透射电镜超微病理结果:空白对照组耳蜗线粒体、粗面内质网结构未发生明显改变;近曲肾小管上皮细胞整体结构正常，基底面有排列整齐的质膜内褶，胞浆及质膜内褶间分布众多线粒体。模型组耳蜗胞浆溶酶体增多，部分出现空泡化;近曲肾小管上皮细胞游离面局部微绒毛脱落，胞浆内多处巨大囊泡扩张。左归丸组耳蜗毛细胞形态结构基本正常，部分胞浆空泡化;近曲肾小管微绒毛排列整齐，胞浆内少量囊泡病变，管腔内有少量絮状物。
　　 (3) TUNEL细胞凋亡结果:空白对照组耳蜗和肾脏有少量凋亡细胞，模型组耳蜗和肾脏TUNEL阳性细胞数目明显增多具有统计学差异（P＜0.01）;与模型组比较，左归丸组和SP600125组耳蜗和肾脏TUNEL阳性细胞数目明显减少，具有显著统计学差异（P＜0.01）。免疫组化结果:空白对照组耳蜗和肾脏JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达较少。与空白对照组相比，模型组JNK、p-JNK、c-Jun蛋白有大量表达，具有显著统计学差异（P＜0.01）。耳蜗主要集中在螺旋器、血管纹、螺旋神经节部位表达;肾脏主要集中在肾小管部位。与模型组相比，左归丸组和SP600125组表达减少，具有显著统计学差异（P＜0.01）。免疫印迹杂交结果:与空白组相比，模型组耳蜗和肾脏JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达显著升高，具有显著统计学差异（P＜0.01）;与模型组相比，左归丸组SP600125组耳蜗和肾脏JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显下降，具有显著统计学差异（P＜0.01）。实时定量PCR结果:与空白组相比，模型组内耳和肾脏JNK mRNA和c-JunmRNA表达显著升高（P＜0.01);与模型组相比，SP600125组JNK mRNA和c-Jun mRNA表达显著下调（P＜0.01）。
　　 结论:
　　 (1)大鼠腹腔注射庆大霉素100mg·kg-1·d-1×10d可以成功建立耳肾损伤模型。
　　 (2)左归丸能够保护耳肾损伤大鼠的听力和肾功能，能够改善耳肾损伤大鼠耳蜗和肾脏病理状况，能够减轻病理性细胞凋亡状态。
　　 (3) JNK/c-Jun通路对庆大霉素诱导的耳肾损伤模型中细胞凋亡起重要调控作用，激活的JNK/c-Jun通路促使病理性细胞凋亡的发生，并参与庆大霉素诱导的耳肾损伤。
　　 (4)左归丸能够抑制JNK通路在耳肾损伤大鼠模型的激活。左归丸对耳肾损伤大鼠的保护作用可能与抑制JNK通路的激活有关。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第一部分 大鼠耳肾损伤模型的建立

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 左归丸对庆大霉素诱导耳肾损伤模型的保护作用

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 左归丸对庆大霉素诱导耳肾损伤模型JNK／c-Jun通路的影响及机制

材料与方法

结果

讨论

结论

结语

参考文献

附录

综述

附二 实验图片

附三 博士在读期间发表文章

致谢