棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在毕赤酵母中的表达

摘要

木霉菌（Trichoderma spp.）是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌，含有很多优良的生物防治基因，棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因就是其中之一。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一类重要的蛋白水解酶，参与机体的新陈代谢及生物调控作用。它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。能够降解抗原，促进其他酶的活化，位点特异性水解逆转录酶病毒前体蛋白以产生病毒体复制所必须的酶蛋白等等。天冬氨酸蛋白酶广泛存在于病毒、真菌、哺乳动物及植物中，参与多种生理过程。天冬氨酸蛋白酶在生物防治等方面具有巨大的应用潜力。
　　为了利用重组天冬氨酸蛋白酶生产广谱抗性的生物农药，本研究采用易于培养、外源蛋白表达量高的毕赤酵母（Pichia pastoris）作为表达生产工具，从已构建好的质粒 p1762-mAsp中通过设计的引物扩增出棘孢木霉的mAsp基因，将经EcoR I和Not I双酶切的mAsp基因和酵母表达载体pPIC9K进行体外连接，构建酵母重组表达载体，经过菌液PCR检测，双酶切检测并测序，得到有正确阅读框的重组表达质粒pPIC9K-mAsp。
　　将pPIC9K-mAsp和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶Sac I线性化后，采用电转化的方法转化 GS115酵母感受态细胞，经过甲醇利用表型的筛选和PCR检测筛选得到2株高效利用甲醇和1株低效利用甲醇的GS115型阳性转化子。通过检测各转化子发酵液上清每隔24h的蛋白表达情况和酶活情况筛选出高效表达天冬氨酸蛋白酶的工程菌株Ga-2和Ga-5。
　　对两株工程菌株分泌的重组mAsp粗酶液进行了酶活测定与酶学特性研究，同时对于重组mAsp的抑菌性进行了初步摸索。发现转化子 Ga-2和Ga-5的产酶高峰出现在3d左右。确定酶系统发挥活性的最佳组合，即温度40℃，pH值4.0，依照该体系以酪氨酸为底物测得的重组蛋白酶发酵液酶活能达到31.6μ/g。
　　重组天冬氨酸蛋白酶粗酶液对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的生长具有一定抑制作用，从而证明了重组蛋白酶具有一定的抑菌能力。用观察菌丝团大小的方法进行重组天冬氨酸蛋白酶粗酶液对病原菌抑菌实验，结果显示其对稻瘟病菌菌丝团的生长具有一定抑制作用，为今后的抑菌研究提供了新的方法，也为生物农药酶制剂研究打下基础。
　　棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有抑制真菌生长的优良特性，这就预示了表达天冬氨酸蛋白酶在工业和生物学领域的广阔应用前景。因此，期望能对该基因进行改造，寻找合适的发酵工艺、探索使酶活稳定的方法，获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株，生产针对植物真菌病害防治的生物农药。

目录

棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在毕赤酵母中的表达

CLONING AND EXPRESSION IN YEAST OFASPARTIC PROTEINASE GENE FROMTRICHODERMA ASPERELLUM

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 课题研究的目的和意义

1.2 国内外研究现状

1.3 课题来源及主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 本章小结

第3章 菌种的鉴定及待研基因的功能分析

3.1 菌种的ITS 序列鉴定

3.2 棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因DNA 序列的克隆

3.3 生物信息学分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 重组天冬氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的表达

4.1 胞外表达质粒pPIC9K-mAsp 的构建及其鉴定

4.2 天冬氨酸蛋白酶基因mAsp 转化整合酵母细胞

4.3 酵母转化子细胞的培养与诱导

4.4 讨论

4.5 本章小结

第5章 重组蛋白酶的酶学特性及抑菌实验

5.1 酶活标准曲线测定

5.2 重组子的产酶高峰

5.3 重组天冬氨酸蛋白的部分酶学特性的研究

5.4 重组蛋白酶抗病原真菌的初步研究

5.5 讨论

5.6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

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致谢