植物乳杆菌细菌素的基因组学及其结构与抑菌作用研究

摘要

植物乳杆菌细菌素因其无毒性和高效性，通常可以作为生物防腐剂应用于食品中，并且被认为可以替代化学防腐剂来提高食品的质量和保证食品的安全。荧光假单胞菌（革兰氏阴性细菌G-，嗜冷菌）为乳品中主要污染菌，即使在冷链运输中乳品也常常因其污染而造成大量损失。大多数已知细菌素对其无抑制作用，而由前期实验所得到的植物乳杆菌细菌素对荧光假单胞菌有明显的抑制作用。本文从植物乳杆菌细菌素的基因组学，结构及其抑菌机理三个方面进行研究，以深入了解能抑制荧光假单胞菌的细菌素及其生产菌株的特点，为其在食品保藏中的应用提供理论支撑。具体研究内容和结果如下：
　　利用全基因组测序对Lactobacillus plantarum Q7所产生的细菌素基因组学进行研究，其结果表明L.plantarum Q7含有1个完整的染色体Chr(2952198bp)和4个完整的质粒，分别为pLP-Q701(12458bp)、pLP-Q702(2968bp)、pLP-Q703(2411bp)、pLP-Q704(11899bp)。通过L.plantarum Q7与其它8株典型的可产生细菌素的植物乳杆菌染色体上基因eggNOG分类注释，结果表明L.plantarum Q7有较强的对物质转运和代谢的广泛遗传适应能力和对外界刺激信号的适应能力。通过蛋白质编码基因的比对，结果表明在质粒 pLP-Q704中存在细菌素 ABC转运基因(pLP-Q704_orf00007)、细菌素转运辅助蛋白(pLP-Q704_orf00008)、细菌素免疫基因(pLP-Q704_orf00009)和细菌素编码基因(pLP-Q704_orf000010)。通过翻译细菌素编码基因(pLP-Q704_orf000010)，结果表明该细菌素的前体肽是含有62个氨基酸的序列并且具有典型的双甘氨酸前导序列和Ⅱ类细菌素相对保守的基因序列-YGNGV-。成熟后的细菌素氨基酸序列为KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC。
　　通过ProtParam软件和PredictProtein软件对细菌素的一、二级结构进行分析，结果表明该序列氨基酸数目为44，相对分子质量为4628.19，并且预测的二级结构为α-螺旋(6.28%)，β-折叠(20.45%)和无规则卷曲(72.73%)。通过圆二色谱(CD)法直接对细菌素Plantaricin Q7的二级结构进行研究，结果表明细菌素在溶液中的二级结构为β-折叠(35.5%)、β-转角(5.8%)和无规则卷曲(58.7%)，与预测结果不一致。通过MALDI-TOF质谱实验，所得到的结果与细菌蛋白库和植物乳杆菌蛋白库进行比对，没有比对出相同的蛋白。
　　通过比色法和荧光探针法初步探究细菌素Plantaricin Q7对Pseudomonas fluorescens的抑菌机理，结果表明细菌素的作用导致了细胞内无机磷离子的泄露，释放ATP，消散了膜跨膜电位(ΔΨ)和pH梯度(ΔpH)，增加了细胞膜的通透性，甚至导致细胞膜形成孔道，最终导致细胞膜的溶解和细胞的破碎。SEM和TEM的结果表明，细菌素会使P.Fluorescens的细胞形态完整性发生改变，破坏细胞膜，从而导致细胞死亡。

目录

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 细菌素的生物合成

1.3 细菌素的作用模式及分析方法

1.4 细菌素的作用受体

1.5 技术路线

1.6 主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 材料及仪器

2.2 全基因组测序

2.3 细菌素结构的研究方法

2.4 细菌素抑菌作用的研究方法

2.5 数据统计与分析

第3章 Lactobacillus plantarum Q7的全基因组分析

3.1 引言

3.2 Lactobacillus plantarum Q7的全基因组序列分析

3.3 系统发育树的构建

3.4 染色体基因功能注释分析

3.5 质粒上基因功能注释分析

3.6 细菌素基因簇分析

3.7 本章小结

第4章 细菌素结构的初探

4.1 引言

4.2 细菌素一级结构的预测

4.4 细菌素的分离纯化

4.5 圆二色谱法(CD)获得细菌素的二级结构

4.6 质谱法验证细菌素的一级结构

4.7 本章小结

第5章 细菌素对荧光假单胞菌抑制机理的研究

5.1 引言

5.2 Pseudomonas fluorescens细胞内溶物的变化

5.3 Pseudomonas fluorescens细胞外膜渗透性的变化

5.4 Pseudomonas fluorescens细胞跨膜电位(ΔΨ)的变化

5.5 Pseudomonas fluorescens胞内外pH梯度(ΔpH)的变化

5.6 Pseudomonas fluorescens表面疏水性的变化

5.7 扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)

5.8 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢