原花青素抑制晚期糖基化终末产物形成和吸收的分子作用机制研究

摘要

晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)是由美拉德反应(Maillard Reaction)形成的，并与诸多疾病相关。本研究旨在研究不同原花青素单体对AGEs形成抑制机制及利用Caco-2细胞研究原花青素对AGEs吸收抑制机制。 主要研究结果如下： 1)研究了(+)-儿茶素(CC)和(-)-表儿茶素(EC)的抗糖化机制与结构-活性的关系。结果显示CC对抑制AGEs的作用明显优于EC(p＜0.05)。通过探索该机制，我们发现CC和EC捕获α-二羰基化合物的能力没有显着差异，但CC比EC更有效地抑制RO·、·OH和·CHO自由基的产生，这可能是CC对AGEs抑制比EC更有效的主要原因。更重要的是，CC对β-葡萄糖苷酶具有更强的抑制作用，这与分子对接结果很一致。 2)探讨了葡萄糖-赖氨酸(G-L)美拉德反应模型溶液中AGEs的形成与乙醇的关系。较高的乙醇浓度加速了模型溶液中AGEs及中间体乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)的形成。随着乙醇浓度的增加，GO和MGO的含量分别从11.74±2.55增加到50.18±0.16μg/mL和19.04±1.25到58.51±2.56μg/mL。较高含量的Nε-羧甲基赖氨酸(CML)和Nε-羧乙基赖氨酸(CEL)存在于较高浓度乙醇的模型溶液中。儿茶素抑制AGEs和中间体形成的能力与乙醇浓度显着相关，这可能与乙醇加速儿茶素降解有关，并且乙醇削弱了儿茶素捕获GO和MGO的能力。 3)探究了原花青素抑制啤酒老化过程中AGEs产生的情况，不同浓度的原花青素加入啤酒中，老化2d和5d后，对啤酒中荧光性AGEs抑制效果CC＞EC＞氨基胍(Aminoguanidine,AG)，对啤酒蛋白含量无影响，对啤酒总酚和色度有显著性影响(P＜0.05)，且呈剂量依赖性。CC和EC对CML也有很好的抑制效果。 4)由牛血清蛋白和乙二醛(GO)糖化后制备成糖化蛋白，经模拟胃肠消化后制得肽-CML(结合态CML)将其与游离态CML分别作用于Caco-2细胞，然后用不同浓度的儿茶素对它们进行干预，结果发现，儿茶素可以降低由CML引起的氧化应激反应。通过免疫组化和Western-blot表明儿茶素可以修复由游离态CML导致的Caco-2细胞间的紧密连接松弛从而抑制了游离态CML的细胞吸收，同时可以通过抑制Caco-2细胞PEPT-1蛋白的表达来抑制结合态CML的细胞吸收。综上所述，本研究结果不仅为不同环境介质下，不同结构的原花青素单体模拟生理条件或者在老化啤酒体系中对AGEs抑制的构效关系以及抑制机制提供了有用的信息，而且利用Caco-2细胞模型为儿茶素抑制CML吸收机制提供了有价值的参考，这对于食品加工的发展和糖尿病的治疗具有重要意义。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 AGEs的概述

1.1.1 AGEs概念的提出

1.1.2 AGEs的形成途径

1.1.3 食源性AGEs的消化吸收与代谢

1.1.4 影响AGEs生成的因素

1.2食源性AGEs的危害性

1.2.1糖尿病

1.2.2阿尔兹海默症

1.2.3动脉硬化

1.2.4肾病

1.3减少膳食AGEs的途径

1.3.1 合理调控膳食营养指标

1.3.2 合理选择食品加工和贮藏方式

1.3.3 使用外源添加剂

1.4原花青素对食源性AGEs的抑制作用与机制

1.4.1原花青素概述

1.4.2 原花青素对AGEs水平的影响

1.5 论文选题的意义

1.6 主要研究内容

第2章 原花青素在模拟生理环境下对AGEs的抑制机制及构效关系研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 主要试剂

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1葡萄糖/麦芽糖-赖氨酸模拟体系的建立

2.3.2 不同浓度CC/EC对AGEs的抑制效果

2.3.3 不同浓度CC/EC对CML的抑制效果

2.3.4 CC/EC对GO/MGO的捕获作用

2.3.5 CC/EC和GO/MGO反应产物的鉴定

2.3.6 用ESR测定 CC/EC对模拟体系中自由基的抑制作用

2.3.7 CC/EC对α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活性的影响

2.3.8分子对接

2.4 结果与分析

2.4.1 CC/EC对葡萄糖/麦芽糖-赖氨酸模拟体系中AGEs的抑制效果

2.4.2 CC/EC对CML的抑制效果

2.4.3 CC/EC对GO/MGO的捕获作用

2.4.4 CC/EC和GO/MGO反应产物的鉴定

2.4.5 CC/EC对模拟体系中自由基的抑制作用

2.4.6 CC/EC对α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活性的影响

2.4.7分子对接

2.5 小结

第3章 乙醇对原花青素抑制AGEs影响的研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1主要试剂

3.2.2 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 模拟体系的建立

3.3.3 乙醇对模拟体系中AGEs的影响

3.3.4 乙醇对模拟体系中GO/MGO含量的影响

3.3.5 乙醇对CML/CEL含量的影响

3.3.6 乙醇对CC捕获GO/MGO能力的影响

3.3.7 乙醇对CC降解率的影响

3.4 结果与分析

3.4.1 乙醇对模拟体系中pH的影响

3.4.2 乙醇浓度对模拟体系中AGEs的影响

3.4.3 乙醇对CC及CC加Fe2+抑制AGEs的影响

3.4.4 乙醇对G-L模拟体系中GO/MGO含量的影响

3.4.5 乙醇对CC捕获GO/MGO能力的影响

3.4.5 乙醇对CML/CEL含量的影响

3.4.6 乙醇对CC降解率的影响

3.5 小结

第4章 儿茶素和表儿茶素对老化啤酒中晚期糖基化终末产物的抑制作用

4.1 引言

4.2材料与方法

4.2.1主要试剂

4.2.2 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 样品的配制

4.3.2 儿茶素和表儿茶素对啤酒老化过程中荧光性AGEs生成的抑制效果

4.3.3 儿茶素和表儿茶素对老化啤酒中蛋白含量的影响

4.3.4儿茶素和表儿茶素对老化啤酒中总酚含量的影响

4.3.5儿茶素和表儿茶素对老化啤酒色度的影响

4.4.1 儿茶素和表儿茶素对啤酒老化过程中荧光性AGEs生成的抑制效果

4.4.2 儿茶素和表儿茶素对老化啤酒中蛋白含量的影响

4.4.3儿茶素和表儿茶素对老化啤酒中总酚含量的影响

4.4.4儿茶素和表儿茶素对老化啤酒色度的影响

4.4.5儿茶素和表儿茶素对啤酒老化过程中CML生成的抑制

4.5 小结

第5章 儿茶素对Caco-2细胞吸收CML抑制作用及机理研究

5.1引言

5.2 材料与方法

5.2.1主要试剂

5.2.2主要仪器

5.3 实验方法

5.3.1细胞培养

5.3.2 细胞活性测定

5.3.3细胞内ROS的测定

5.3.4 消化液配制

5.3.5 CML在Caco-2细胞中的吸收

5.3.6 免疫组化染色

5.3.7 蛋白免疫印

5.4 结果与讨论

5.4.1药物对Caco-2细胞活力的影响

5.4.2 CC对Caco-2细胞内ROS生成的影响

5.4.3 CC对Caco-2细胞吸收游离态/结合态CML的影响

5.4.4 CC对Caco-2细胞中ZO-1蛋白表达的影响

5.4.5 CC对Caco-2细胞中PEPT-1蛋白表达的影响

5.5 小结

第6章结论与展望

6.1结论

6.2 展望

参考文献

致谢

附录