猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白不同抗原片段在重组干酪乳杆菌中的表达及其免疫学评价

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。此病多发生于冬季12月至来年2月寒冷季节,在夏季也可发生。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100％,成年母猪为15%~19%,以哺乳仔猪受害最严重,死亡率可达95%以上,而成年猪死亡率在10%以下。PEDV主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口自然感染,新生仔猪潜伏期为24-36小时,肥育猪为2日以上,病猪腹泻开始时排黄色粘稠便,以后变成水样便,腹泻的同时伴有精神沉郁,厌食,消瘦及衰竭。年龄越小,症状越严重,死亡率越高。PED在世界上分布很广,呈现地方性流行性。近年来,流行区域有逐渐扩大的趋势,危害比较严重,给养猪业带来重要经济损失。本研究首先克隆了PEDV LJB/03株s、n基因,并对其分子特征、遗传变异作出分析,结果显示,不同毒株间的变异率很小,表现出了高度的保守性,适合用作基因工程疫苗研究。针对目前PEDV保护性抗原还不清楚的现状,试验中利用实验室构建的重组大肠杆菌,诱导并纯化了PEDV S蛋白的各个片段s1(22-505aa)、S2(488-980aa)、S34(951-1383aa)、PS420(461-638aa)、S22(502-792aa)以及N蛋白,之后利用纯化蛋白免疫试验兔制备高免血清,以高免血清做中和试验,结果显示,除N蛋白外,所有重组蛋白的抗血清的均具有一定的中和活性,中和效价在1:23~1:93之间,其中以S1、S22、PS420的抗血清中和活性较高,分别可达1:93、1:74、1:89;S34中和效价为1:52;S2抗血清中和效价较低,为1:23;抗血清组合后中和效价呈现不同程度的提高,其中以S1、S22、PS420组合抗血清中和活性最好,可达1:363:S1、S2、S34抗血清组合中和活性为1:199,S22与PS420抗血清组合中和活性1:186。从而筛选出适合于基因工程疫苗研究的基因片段。为探讨大肠杆菌不耐热肠毒素B单位(LTB)在乳酸菌传递系统的佐剂活性,并进一步提高PS420的免疫原性,试验中克隆了LTB基因并与ps420基因融合,命名为lp0。以筛选到的免疫保护性抗原蛋白的基因ps1(包含S1、PS420、S22)、ps420、lp0、n为靶基因,分别亚克隆至细胞表面表达型乳酸菌载体pPG-1及分泌表达型乳酸菌载体pPG-2中,电转化后,构建了表达PEDV免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统。将获得的8种重组干酪乳杆菌以2%乳糖为诱导剂进行诱导表达。细胞表面表达型重组干酪乳杆菌诱导后经Western blot、间接免疫荧光、全菌体ELISA试验证实,蛋白获得表达,并且定位于干酪乳杆菌菌体表面;分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,Western blot、间接ELISA实验表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。为探讨表达重组的重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠为实验动物,进行免疫学研究。共分为pPG-1-lp0/L.casei393免疫组、pPG-2-lp0/L.casei393免疫组、pPG-1-ps420/L.casei393免疫组、pPG-2-ps420/L.casei393免疫组、pPG-1-n/L.casei393免疫组、pPG-2-n/L.casei393免疫组、pPG-1-ps1/L.casei393免疫组、pPG-2-ps1/L.casei393免疫组、pPG-1联合免疫组(pPG-1-n/L.casei393、pPG-1-ps1/L.casei393)、pPG-2联合免疫组(pPG-2-n/L.casei393、pPG-2-ps1/L.casei393)、pPG-1/L.casei393免疫对照组、pPG-1/L.casei393免疫对照组、PBS对照组,共13组。口服接种10~9活菌量,每2周免疫一次,共免疫三次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。免疫后分别于0d、7d、21d、35d、49d、63d、77d收集免疫小鼠新鲜粪便、血液、眼冲洗物、鼻腔冲洗液、外生殖道冲洗液等样品。分别测定样品中特异性的sIgA以及小鼠血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况,并检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、眼冲洗液、鼻冲洗液、外生殖道冲洗液、肠黏液中均检测到了特异性sIgA,各组一般在免疫后21d即可产生明显的抗体水平(P<0.05),第35d或49d达到sIgA抗体水平最高峰,与和对照组相比,差异均为显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),到77d也可检测到抗体存在。同时在小鼠血清中检测到了较高水平的血清抗体,各组一般在免疫后21d即可产生明显的抗体水平(P<0.05),第35d或49d达到sIgA抗体水平最高峰,和对照组相比,差异均为显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),到77d也可检测到抗体存在。淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。口服免疫效果表明,该8种重组干酪乳杆菌表达系统均能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,不但在肠道,而且在眼、鼻、外生殖道等部位均可产生分泌型IgA抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫效应。中和试验结果表明,血清抗体、肠粘液sIgA均有一定的保护效果,血清抗体中和效价在1:6~1:93之间,肠黏液IgA中和效价1:3~1:35之间。试验证实细胞表面表达型干酪乳杆菌系统可诱导比分泌表达型干酪乳杆菌系统具有更好的免疫反应;表达ps1基因的重组干酪乳杆菌和表达n基因的重组干酪乳杆菌联合免疫可诱导更强的免疫应答;导向分子LTB的引入增强了重组乳酸菌疫苗的免疫效果,具有佐剂效应。以上结果说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型PED口服疫苗的研制奠定了基础。

目录

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1.引言

1.1 研究的目的和意义

1.2 猪流行性腹泻的流行与危害

1.3 PEDV的病原学特征

1.3.1 PEDV的分类地位与生物学特征

1.3.2 PEDV的病原性

1.3.3 PEDV的分子生物学特征

1.3.4 PEDV的受体研究

1.3.5 PEDV的抗原表位研究

1.4 PEDV的免疫学研究概况

1.4.1 PEDV感染仔猪的免疫反应

1.4.2 PEDV感染后的抗体产生及其保护作用

1.4.3 PED疫苗的研究

1.5 乳酸杆菌表达外源抗原研究进展

1.5.1 乳酸杆菌受体系统

1.5.2 乳酸杆菌的益生作用

1.5.3 乳酸杆菌作为抗原表达载体的优势

1.5.4 乳酸杆菌与黏膜免疫

1.5.5 乳酸杆菌表达抗原及免疫效果

1.5.6 乳酸杆菌口服疫苗展望

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 病毒与细胞

2.1.2 菌种与质粒

2.1.3 引物

2.1.4 试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 试验动物

2.1.7 血清

2.2 实验方法

2.2.1 n和s基因克隆与序列分析

2.2.2 全长s基因的获得

2.2.3 PEDV N蛋白和S蛋白的免疫原性分析

2.2.4 分子佐剂LTB基因的克隆及其与ps420基因串联

2.2.5 表达不同基因片段的重组干酪乳杆菌的构建

2.2.6 免疫效果评价

3.实验结果

3.1 RT-PCR结果

3.2 测序结果与序列分析

3.3 s基因克隆结果

3.4 大肠杆菌中外源蛋白表达及纯化

3.5 抗血清滴度检测

3.6 中和试验

3.7 重组表达载体的鉴定

3.8 重组乳杆菌的表达鉴定

3.8.1 细胞表面表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果

3.8.2 分泌表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果

3.9 免疫小鼠后特异性抗体检测结果

3.9.1 小鼠血清中特异性IgG检测结果

3.9.2 免疫小鼠鼻冲洗液中特异性sIgA检测结果

3.9.3 免疫小鼠粪便中特异性sIgA检测结果

3.9.4 免疫小鼠外生殖道冲洗液中特异性sIgA检测结果

3.9.5 免疫小鼠眼冲洗液中特异性sIgA检测结果

3.9.6 肠粘液中特异性sIgA检测结果

3.10 特异性淋巴细胞增殖试验

3.11 细胞因子测定结果

3.12 口服重组干酪乳杆菌免疫小鼠所获得的血清抗体及肠黏液抗体中和试验结果

4.讨论

4.1 PEDV LJB/03株s和n基因的分子特征

4.2 课题设计思路

4.3 PEDV抗原片段筛选及其意义

4.4 表达不同抗原片段的重组乳酸杆菌的免疫效果分析

4.5 提高乳酸杆菌转化效率的关键技术

5.结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文