香菇多糖提取和β-葡萄糖苷酶应用研究

摘要

香菇中的香菇多糖具有抗癌、抗肿瘤等多种生物活性。香菇β-葡萄糖苷酶在食品加工、生产中有着广泛的应用。本试验以香菇为原料，探索从其中提取香菇β-葡萄糖苷酶，水解大豆异黄酮和豆渣；提取香菇β-葡萄糖苷酶后剩余的香菇渣中还含有部分的香菇多糖，对其进一步提取纯化，主要通过热水浸提、超声辅助提取、微波辅助提取和亚临界水提取四种方法提取香菇多糖，醇沉后并用Sevag法除去香菇多糖中的蛋白。并测定香菇多糖的抗氧化活性。
　　 测定多糖的方法主要是用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，通过苯酚-硫酸法测定溶液中的总糖的含量，换算得到多糖的含量。本试验对苯酚-硫酸方法进行了进一步研究，确定了该方法有很好的稳定性和重现性，确定测定多糖最佳波长为490nm，最佳的提取液稀释倍数为200倍。
　　 采用热水浸提法提取香菇多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳的热水浸取条件：提取温度100℃，液固比40mL/g，提取时间3h，提取2次。采用超声辅助法提取香菇多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳超声辅助提取条件：提取温度70℃，超声时间45min，液固比30mL/g，超声功率80W，提取2次。采用微波辅助法提取香菇多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳微波辅助提取条件：浸提温度90℃，微波萃取时间10min，液固比25mL/g，微波功率是800W，提取2次。采用亚临界水法提取香菇多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳亚临界水法提取条件：亚临界水温度150℃，液固比30mL/g，浸提时间为5min，浸提次数为2次。
　　 四种方法最佳条件下提取香菇多糖得率为：热水浸提法4.90％，超声辅助提取法5.17％，微波辅助提取法4.83％，亚临界水法7.63％；提取时间依次为：3h，45min，10min，5min；液固比依次为40mL/g，30mL/g，25mL/g，30mL/g；提取温度依次为100℃，70℃，90℃，150℃。由以上数据可知，热水浸提法提取香菇多糖的耗时最长，料液比较大，温度要求高；超声辅助提取法相对于传统热水浸提法，提取时间缩短很多，液固比也减小，温度要求最低。微波辅助提取法提取时间相对于以上两种方法提取时间又缩短一些，液固比也相对减小，但是香菇多糖的得率稍微有所下降。亚临界水提取方法提取率最高，提取瞬间完成。在实际生产过程中，要根据实际情况选择适宜的提取方法。
　　 通过醇沉试验选择的最佳乙醇醇析终浓度为80％。Sevag法除蛋白的选定因素、水平进行正交试验。得到Sevag法对香菇多糖提取液除蛋白的最优条件振荡时间为2min、静置时间20min、样液与Sevag试剂体积比为2:1、氯仿与正丁醇体积比为3:1。粗多糖样品经四次Sevag法纯化多糖纯度达到92.26％。
　　 进行了香菇β-葡萄糖苷酶水解豆渣的研究。香菇β-葡萄糖苷酶水解鲜豆渣试验中，水溶性多糖含量由0.21g/L增加到0.27g/L；水解55℃下烘干豆渣试验中，水溶性多糖含量由0.80g/L增加到1.24g/L；水解90℃下烘干豆渣试验中，水溶性多糖含量由0.52g/L增加到0.78g/L。采用豆渣酶解途径进行放大实验，取55℃下烘干豆渣100g，选用香菇β-葡萄糖苷酶进行水解，水溶性多糖含量由0.82g/L增加到1.26g/L，水溶性多糖含量增加了54％。
　　 进行了香菇β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的研究。香菇β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮后，得到产品1.6g，黄豆苷水解率为98.15％，染料木苷水解率94.23％。
　　 对香菇多糖进行了抗氧化活性测定研究，研究结果表明，香菇多糖具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH自由基，其清除率可达55.0％；羟基自由基清除率可达76.5％，与同浓度下的Vc接近。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS英文目录

1 引言

1.1 立题背景

1.2 β-葡萄糖苷酶的研究进展

1.2.1 β-葡萄糖苷酶的理化性质

1.2.2 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制

1.2.3 β-葡萄糖苷酶活性的测定方法

1.2.4 β-葡萄糖苷酶的应用

1.3 香菇多糖的研究进展

1.3.1 香菇多糖理化性质

1.3.2 香菇多糖应用的研究

1.3.3 香菇多糖的临床应用研究

1.4 国内外香菇多糖提取方法的研究

1.4.1 水浸提法

1.4.2 酸浸提法

1.4.3 碱浸提法

1.4.4 酶提取法

1.4.5 超声辅助提取法

1.4.6 微波辅助提取法

1.4.7 亚临界水提取法

1.5 多糖的定量方法

1.6 香菇多糖中除蛋白的方法比较及蛋白测定

1.6.1 Sevag法除蛋白

1.6.2 三氟三氯乙烷法

1.6.3 三氯乙酸法：

1.6.4 酶法脱蛋白

1.6.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

1.7 立题意义

1.8 本论文主要的研究内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验原料

2.1.2 试验试剂

2.1.3 试验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 原料分析

2.2.2 香菇精深加工工艺路线

2.2.3 香菇活性物质的提取

2.2.4 香菇多糖的提取方法和纯化的研究

2.2.5 香菇β-葡萄糖苷酶的应用研究

2.2.6 香菇多糖的抗氧化活性研究

3 结果与分析

3.1 原料成分结果

3.2 香菇多糖的测定方法研究

3.2.1 还原糖含量测定的标准曲线

3.2.2 总糖测定方法的研究

3.3 其他成分的测定方法

3.3.1 蛋白质含量的快速测定方法

3.3.2 高效液相色谱法测定大豆异黄酮标准曲线

3.4 热水浸提法提取香菇多糖条件的确定

3.4.1 提取时间对香菇多糖得率的影响

3.4.2 液固比对香菇多糖得率的影响

3.4.3 提取温度对香菇多糖得率的影响

3.4.4 提取次数对香菇多糖得率的影响

3.4.5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定

3.5 超声辅助法提取提取香菇多糖条件的确定

3.5.1 提取时间对香菇多糖得率的影响

3.5.2 液固比对香菇多糖得率的影响

3.5.3 提取温度对香菇多糖得率的影响

3.5.4 超声功率对香菇得率的影响

3.5.5 提取次数对香菇多糖得率的影响

3.5.6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定

3.6 微波辅助法提取香菇多糖条件的确定

3.6.1 提取时间对香菇多糖得率的影响

3.6.2 液固比对香菇多糖得率的影响

3.6.3 提取温度对香菇多糖得率的影响

3.6.4 微波功率对香菇多糖得率的影响

3.6.5 提取次数对香菇多糖得率的影响

3.6.6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定

3.7 亚临界水法提取香菇多糖条件的选择

3.7.1 提取时间对香菇多糖得率的影响

3.7.2 液固比对香菇多糖得率的影响

3.7.3 亚临界水提取温度对香菇多糖得率的影响

3.7.4 提取次数对香菇多糖得率的影响

3.7.5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定

3.8 四种方法提取香菇多糖的比较

3.9 香菇多糖醇沉条件的选择

3.10 Sevag法对香菇多糖除蛋白条件的研究

3.10.1 振荡时间对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响

3.10.2 静置时间对香菇多糖提取液除蛋白的影响

3.10.3 样液与Sevag试剂体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响

3.10.4 氯仿与正丁醇体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响

3.10.5 蛋白质脱除最佳条件的确定

3.10.6 香菇多糖Sevag法除蛋白后的纯度测定

3.11 香菇β-葡萄糖苷酶液的应用研究

3.11.1 香菇β-葡萄糖苷酶液水解豆渣的研究结果

3.11.2 香菇β-葡萄糖苷酶液水解大豆异黄酮的研究结果

3.12 香菇多糖的抗氧化活性研究

3.12.1 香菇多糖还原能力的测定

3.12.2 香菇多糖清除DPPH自由基的测定

3.12.3 香菇多糖清除羟基自由基（·OH）的测定

4 结论

4.1 创新点

4.2 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文