β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选、培养条件优化及β-葡萄糖苷酶应用研究

摘要

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的一个关键组分，在纤维素降解中起重要作用。其酶活的高低直接影响纤维素的降解效率。他们还能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，用于食品和饮料工业中。但就目前已知的纤维素酶产生菌株来看，其β-葡萄糖苷酶的酶活普遍偏低，对这些菌株进行分子改造又耗时耗力。从自然界中直接筛选β-葡萄糖苷酶酶活较高的出发菌株，是获得β-葡萄糖苷酶高产菌株的最直接有效的方法。 本论文主要研究内容及结果如下： 1．本论文受到细菌“胆汁-七叶苷”实验的启发，改造发明了一种快速、高效的筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法-七叶苷平板法，利用这种方法，从富含腐烂秸秆的土壤中筛选得到了13株具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株。通过酶活测定，其中3株酶活较高，主要对其中酶活最高的一个菌株Peni-1进行了研究。首先通过形态观察和18S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为斜卧青霉。 2．为了进一步提高该菌株的酶活，本论文对该Perni-1菌株的发酵培养基和发酵条件进行了优化，通过单因子和正交实验，得到了最佳培养基配比，即麦麸3．0％，草粉3．0％，微晶纤维素0．6％，（NH4）2SO40．4％，KH2PO40．1％，MgSO40．05％，CaCl20．05％，微量离子液1．0 ml/L培养基；最佳培养条件为：装液量为50 ml（300 ml锥形瓶），摇床转速，200 r/min，培养温度，30℃。培养基和培养条件优化后使得该菌株的酶活较优化前提高了4倍，在发酵第6d时达到15．3 IU/ml。这较文献中报道的青霉、曲霉、木霉以及其它菌株的β-葡萄糖苷酶酶活都有明显的优势。 3．论文还对该菌株所产生的β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行了研究，酶促反应的最适温度测定结果表明，该酶的最适反应温度为70℃，在此温度下β-葡萄糖苷酶的酶活达到44．3 IU/ml，较在原来测定温度下（50℃）的酶活提高了将近2倍，且该酶在0～70℃都具有很好的热稳定性。这较文献已报到的β-葡萄糖苷酶的热稳定性高出很多，酶促反应的最适pH测定结果表明，该酶反应的最适pH为4．5，这与文献已报到的曲霉、木霉等菌株的β-葡萄糖苷酶最适pH相似，且在pH3．0～10．0之间有很好的稳定性。 4．为了从分子水平研究该菌株酶活较高的原因，对该菌株的β-葡萄糖苷酶基因全序列进行了克隆。并与实验室菌株斜卧青霉JU-A10的β-葡萄糖苷酶基因进行比较，找出了这两个菌株的酶基因序列上的差异，为以后的研究提供了参考。 5．β-葡萄糖苷酶除了作为纤维素酶的一个关键组分在纤维素降解中起重要作用以外，还广泛应用与其它领域，如食品增香，果酒增香等。本文将β-葡萄糖苷酶应用于中药虎杖中自藜芦醇苷的水解，是β-葡萄糖苷酶应用的一个崭新领域。绝大多数植物中的天然糖苷都是β-糖苷，虎杖中的白藜芦醇苷也不例外，β-葡萄糖苷酶能够快速、高效的将白藜芦醇苷水解为白藜芦醇和葡萄糖，且白藜芦醇苷的转化率在90％以上。 在大规模工业中应用β-葡萄糖苷酶水解白藜芦醇苷，其成本是一个重要限制性因素，固定化酶在提高工业酶的生产稳定性方面具有很大的优势。本论文应用固定化的β-葡萄糖苷酶来水解虎杖样品，同样能够达到很好的水解效果。固定化的β-葡萄糖苷酶具有很好的稳定性和重复利用性，使用同一批固定化酶对虎杖进行水解，连续水解6次，白藜芦醇苷的转化率均保持在85％以上。 本论文还初步研究了白藜芦醇的提取方法，白藜芦醇微溶于水，易溶于乙醇，甲醇、丙酮等有机溶剂。由于乙醇在经济上和安全性上都优于其它试剂，所以本文采用乙醇回流法提取经β-葡萄糖苷酶水解的虎杖样品，将95％乙醇按液料比15：1加热回流提取3次，每次2 h，白藜芦醇的提取量达5．8 mg/g。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1葡萄糖苷酶的酶学特性及催化机制

1.1.1 β-葡萄糖苷酶的酶学特性

1.1.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制

1.2 β-葡萄糖苷酶的分子生物学

1.2.1 β-葡萄糖苷酶基因

1.2.2微生物β-葡萄糖苷酶的表达

1.3 β-葡萄糖苷酶的应用

1.3.1葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用

1.3.2 β-葡萄糖苷酶在在食品工业中的应用

1.3.4 β-葡萄糖苷酶在茶叶增香中的应用

1.3.5 β-葡萄糖苷酶在生产大豆异黄酮活性苷元中的应用

1.3.6 β-葡萄糖苷酶在转化虎杖中白藜芦醇苷生成白藜芦醇的应用

1.4本论文的目的及意义

第二章β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及菌株鉴定

2.1材料与方法

2.1.1土样

2.1.2培养基

2.1.3主要仪器及生化试剂

2.1.4 β-葡萄糖苷酶产生菌的分离筛选

2.1.5粗酶液的制取

2.1.6 β-葡萄糖苷酶活力测定(DNS法)

2.1.7菌株Peni-1形态观察

2.1.8菌株Peni-1 18 S rDNA鉴定

2.2结果与分析

2.2.1 β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选

2.2.2菌株Peni-1的鉴定

2.3小结

第三章菌株Peni-1产酶条件的优化及粗酶性质研究

3.1材料与方法

3.1.1菌株和培养基

3.1.2仪器及试剂

3.1.3粗酶液的制取

3.1.4酶活测定

3.1.5产酶发酵培养基优化

3.1.6产酶发酵培养条件优化

3.1.7斜卧青霉Peni-1 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

3.2结果与分析

3.2.1产酶发酵培养基的优化

3.2.2产酶发酵培养条件的优化

3.2.3 Peni-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质

3.3小结

第四章斜卧青霉Peni-1 β-葡萄糖酶基因克隆

4.1材料和方法

4.1.1菌株与培养基

4.1.2主要仪器与试剂

4.1.3常用储备液及缓冲液

4.1.4基因组DNA的提取

4.1.5斜卧青霉Peni-1部分序列的扩增

4.1.6高保真扩增基因全长

4.2结果与分析

4.2.1斜卧青霉Peni-1部分序列扩增

4.2.2高保真扩增β-葡萄糖苷酶基因全长

4.3小结

第五章固定化β-葡萄糖苷酶水解白藜芦醇苷生成白藜芦醇

5.1材料与方法

5.1.1仪器与试剂

5.1.2粗酶液的制取

5.1.3 β-葡萄糖苷酶的固定化

5.1.4固定化β-葡萄糖苷酶的酶活测定

5.1.5固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率测定

5.1.6固定化β-葡萄糖苷酶对虎杖中白藜芦醇苷的水解

5.1.7虎杖中自藜芦醇苷和白藜芦醇含量以及白藜芦醇苷转化率测定

5.1.8 β-葡萄糖苷酶作用时间对白藜芦醇苷转化率的影响

5.1.9白藜芦醇的提取

5.2结果与分析

5.2.1 β-葡萄糖苷酶的固定化

5.2.2固定化β-葡萄糖苷酶对虎杖中白藜芦醇苷的转化

5.2.3固定化β-葡萄糖苷酶的重复利用性

5.2.4固定化β-葡萄糖苷酶作用时间对白藜芦醇苷转化率的影响

5.2.5白藜芦醇苷和白藜芦醇的提取

5.3小结

参考文献：

致谢