乳杆菌发酵工业废料海藻残渣产有机酸的研究

摘要

海藻体内含有大量油脂，利用它生产柴油具有成本低、占据空间小等特点，而且它的产油量较农作物要高出数十倍。因此，海藻常被作为可再生资源应用在生物柴油的工业生产中。而在生产后产生的剩余物便成为了废弃物即海藻残渣。海藻残渣单糖成分主要有葡萄糖、果糖、半乳糖等，除此之外还富含多种氨基酸，这些都是乳酸菌生长所需的营养物质，可以被乳酸菌充分利用，以促进其生长代谢。我们希望能够利用这种廉价的海藻残渣，使乳酸菌代谢生成高价值的副产品——乳酸，从而降低生产成本，达到促进现代发酵工程发展的目的。目前国内对海藻残渣的研究集中在对金属离子的吸附性和有机肥料的改良上，涉及乳酸菌发酵方面的非常少。而对乳酸菌代谢有机酸这方面的研究几乎没有。因此本实验对乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸的过程进行了实验研究。
　　本研究以保加利亚乳杆菌11842和植物乳杆菌09004这两种乳杆菌为实验对象，在以2％(w/v)海藻残渣(Acm)、2％(w/v)Acm+1％(w/v)葡萄糖(Glu)、10％(w/v)Acm及对照组MRS这四种溶液为发酵底物的条件下，用涂布计数法了解海藻残渣对菌数的影响，用高效液相色谱法(HPLC)分析有机酸（乳酸、乙酸）、中间代谢产物乙酰辅酶A以及代谢过程中ATP的变化情况，用试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)、乙酸激酶(ACK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)的活性并通过分光光度计法和比色法对其变化进行分析。最后根据变化情况重新构建代谢图谱。
　　研究结果表明:在海藻残渣培养基里生长的乳酸菌(包括保加利亚乳杆菌11842和植物乳杆菌09004)生长16h后，其菌落数均小于对照组:2％(w/v)海藻残渣(Acm)里的菌落数最少，其中保加利亚乳杆菌11842较对照组低12.0％，植物乳杆菌较对照组低14.2％;2％(w/v)Acm+1％(w/v)葡萄糖(Glu)与10％(w/v)Acm这两种培养基里的菌落数相近，其中保加利亚乳杆菌11842在这两种培养基里比对照组低了5.7％左右，植物乳杆菌09004较对照组低了约6.9％。而乳杆菌在三种海藻残渣培养基里所产生的乳酸、乙酸都比对照组低了90％左右。同时在海藻残渣培养基里，乳杆菌胞内ATP的含量也表现出大幅度下降的趋势。相反，乙酰辅酶A的含量却大大增加，且在2％(w/v)Acm中含量最高，比对照高120％以上。
　　本研究还分析了代谢有机酸途径中关健酶的活性，发现三组海藻残渣培养基中乳酸脱氢酶的活性和丙酮酸激酶的活性均有明显的下降趋势，且在2％(w/v)Acm中活性最低;而磷酸果糖激酶的酶活力略高于对照组;乙酸激酶的活力明显高于对照组。说明乳杆菌发酵海藻残渣通过调节代谢途径的相关酶而影响了代谢活动。
　　本研究可得到以下结论:海藻残渣适于乳杆菌的生长和存活，且在其中加入葡萄糖或是增加海藻残渣的浓度对乳杆菌的生长以及产酸更有利。海藻残渣促进乳杆菌中间代谢产物乙酰辅酶A的生成，可能致使乳酸和乙酸产量大大降低。乙酰辅酶A有促进细胞膜合成的作用，更利于菌体的生长。海藻残渣可以使菌体通过调控代谢相关酶的活性而调节代谢活动。结合实验数据，对乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸路径进行了构建，可以为今后发酵海藻残渣的工业生产提供依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 海藻残渣

1．2．1 海藻残渣的生成

1．2．2 国内外关于海藻残渣的研究进展

1．3 乳杆菌概述

1．3．1 乳杆菌生物学特性

1．3．2 乳杆菌的生理功能

1．3．3 乳杆菌的应用

1．4 乳杆菌的代谢

1．4．1 关于代谢的研究热点

1．4．2 代谢产酸的作用与意义

1．4．3 代谢产酸的相关途径

1．5 研究目的与研究内容

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究内容

1．6 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 实验所需药品

2．1．3 培养基及实验所需溶液

2．2 实验所用仪器

2．3 实验方法

2．3．1 实验供试菌株的保存和活化

2．3．2 实验供试菌株的培养

2．3．3 实验菌体湿重和干重的测定

2．3．4 乳酸菌在不同培养基中生长情况及pH的测定

2．3．5 乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸相关产物的测定

2．3．6 乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸相关酶活性的测定

2．4 乳杆菌发酵海藻残渣能量代谢

2．5 统计学分析

3 结果与分析

3．1 乳杆菌发酵海藻残渣的菌数及pH变化

3．2 乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸及相关产物的含量变化

3．2．1 乳杆菌发酵海藻残渣过程中乳酸含量的变化

3．2．2 乳杆菌发酵海藻残渣过程中乙酸含量的变化

3．2．3 乳杆菌发酵海藻残渣过程中乙酰辅酶A含量的变化

3．3 乳杆菌发酵海藻残渣代谢有机酸路径中相关酶活性的变化

3．3．1 无细胞提取液中蛋白质定量

3．3．2 磷酸果糖激酶活性

3．3．3 丙酮酸激酶

3．3．4 乳酸脱氢酶的活性

3．3．5 乙酸激酶的活性

3．4 乳杆菌发酵海藻残渣代谢途径中能量的变化

4 讨论

4．1 乳杆菌发酵海藻残渣对代谢产物的影响

4．2 乳杆菌发酵海藻残渣对代谢相关酶的影响

4．3 乳杆菌发酵海藻残渣对代谢路径的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文