白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中的表达研究

摘要

酸性蛋白酶是具有较低的最适pH(2～4)并能在低pH条件下，有效水解蛋白质为氨基酸和小肽的酶类。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物生长分泌产生，许多微生物都具有产生酸性蛋白酶的能力。它于本世纪50年代，首先于黑曲霉中被发现，80年代初我国开始通过黑曲霉固体或液体发酵法生产酸性蛋白酶。随后应用领域不断扩大，在酒精、白酒、啤酒、酿造、饲料添加、皮革加工以及医药等行业的需求量也逐步增加。
　　肇东市日成酶制剂有限公司的固态发酵酸性蛋白酶具有液态下稳定的特点，克服了大多数液体酸性蛋白酶保存期短的缺点。但是，较之液态发酵所具有的机械化程度高、技术管理严格、酶产率高以及质量稳定、产品回收率高等特点，固态发酵的生产方式限制了其大规模的生产和应用。本实验选用适合于液态发酵的糖化酶生产菌黑曲霉CICC2462为转化受体菌，用以表达该酸性蛋白酶，为创制高产液态下稳定的酸性蛋白酶菌种探索新的途径，具有重要应用价值。
　　实验主要研究结果如下:
　　1.固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品的鉴定
　　PCR扩增固态发酵酸性蛋白酶生产菌株的ITS区，序列鉴定结果表明该菌株为曲霉属。SDS-PAGE分离商品酶中的目的蛋白条带，质谱检测结果表明该商品酶为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18)。
　　2.酸性蛋白酶基因的克隆及表达载体的构建
　　根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因pep1序列(GI:473517)设计引物，以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明，扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99％，其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶(GAA90749.1)相似性为100％，将该基因命名为pepB。然后以黑曲霉中高表达的糖化酶基因(glaA)位点为靶位点，构建了黑曲霉基因置换表达载体pSZHG-pepB。
　　3.农杆菌介导法转化黑曲霉及酸性蛋白酶同源重组转化子的筛选
　　利用冻融法将黑曲霉重组表达载体pSZHG-pepB转入农杆菌AGL1中，再通过农杆菌介导法对黑曲霉菌丝体进行遗传转化。采用PCR技术通过同源重组引物对抗性菌落的基因组DNA进行鉴定，结果表明pSZHG-pepB的阳性转化子均为同源重组菌株，同源重组率为100％。经过对同源重组菌株的继代培养，成功筛选得到了pSZHG-pepB纯合同源重组菌株。
　　4.纯合同源重组菌株中酸性蛋白酶的表达分析
　　将pSZHG-pepB纯合同源重组菌株与出发菌株同时进行摇瓶发酵培养，通过福林酚法测定酸性蛋白酶的酶活性，结果表明pSZHG-pepB最高酶活力可达7614.173 U/mL，是出发菌株的209倍。SDS-PAGE检测显示纯合同源重组菌株发酵液上清在47 KDa处有明显目的条带。
　　5.酸性蛋白酶酶学性质和稳定性分析
　　pSZHG-pepB纯合同源重组菌株酶学性质检测结果为:酶作用最适反应温度为50℃，最适pH为3.0，并且粗酶液置4℃时和25℃时均在pH3.0-4.0较稳定，当pH低于3.0或高于4.0时，酶活均有下降。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究目的与意义

1．2 文献综述

1．2．1 酸性蛋白酶的概述

1．2．2 黑曲霉表达系统的研究进展

1．3 本论文主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与载体

2．1．2 酶和主要试剂

2．1．3 常用试剂的配制

2．1．4 培养基

2．1．5 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 黑曲霉基因组的提取

2．2．2 基因的克隆

2．2．3 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

2．2．4 黑曲霉同源重组菌株的鉴定

2．2．5 纯合同源重组菌株的筛选与鉴定

2．2．6 重组菌株中酸性蛋白酶酶活的测定

2．2．7 重组菌株中酸性蛋白酶酶学性质分析

2．2．8 重组菌株中酸性蛋白酶稳定性分析

3 结果与分析

3．1 酸性蛋白酶生产菌株的鉴定

3．2 商品酸性蛋白酶的鉴定

3．3 白曲霉酸性蛋白酶黑曲霉表达载体的构建

3．3．1 白曲霉pepB基因的扩增

3．3．2 酸性蛋白酶pepB基因连接T载体鉴定结果

3．3．3 酸性蛋白酶pepB基因黑曲酶表达载体pSZHG-pepB的构建

3．4 农杆菌介导法对黑曲霉的遗传转化

3．4．1 冻融法转化农杆菌

3．4．2 农杆菌介导法转化黑曲霉及转化子的筛选

3．4．3 黑曲霉同源重组菌株的鉴定

3．5 pSZHG-pepB重组菌株的表达检测

3．5．1 pSZHG-pepB重组菌株酸性蛋白酶的SDS-PAGE检测

3．5．2 pSZHG-pepB重组菌株酸性蛋白酶的活性检测

3．6 pSZHG-pepB重组菌株中酸性蛋白酶酶学性质分析

3．6．1 温度对酶活力的影响

3．6．2 pH对酶活力的影响

3．7 pSZHG-pepB重组菌株中酸性蛋白酶稳定性分析

4 讨论

4．1 酸性蛋白酶稳定性分析

4．2 白曲霉酸性蛋白酶基因序列的分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文