高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用。一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含酸性蛋白酶基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含酸性蛋白酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记等元件的基因片段。按照本发明所述的方法构建的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株。本发明所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。本发明通过基因工程的手段，构建了酸性蛋白酶的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了酸性蛋白酶的高效分泌表达，获得了高产酸性蛋白酶黑曲霉表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵表达水平可达25000‑26000U/ml。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程育种领域，涉及一种高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株的构建及重组表达菌株液体发酵技术。

背景技术

酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5–5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000-40000，等电点为3.0-5.0。其主要的来源为动物的脏器(胃蛋白酶等)和微生物分泌物。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。

自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。目前酸性蛋白酶大都来源于微生物。产酸性蛋白酶菌株主要有黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、斋藤曲霉(A.saitoi)、泡盛酒曲霉(A.awamori)、宇佐美曲霉(A.usamii)、微小毛霉(Mucor pusillus)、青霉(Penicilliumspp.)、根霉(Rhizopus spp)等以及它们的变异株、突变株。此外，中华根霉(Rhizopuschinensis)、陆生酵母中如酿酒酵母(Saccharomyces cescerevisiae)、白色假丝酵母(Candida albicans)等也分泌酸性蛋白酶。商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。

我国从上世纪60年代开始微生物产酸性蛋白酶的研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3.350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3.350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。目前，国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537及其突变菌株进行发酵生产。中国专利CN 102676395 A公开了一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用，所述宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp.)M1223采用液体深层发酵，该酶最适作用温度为40℃，最适作用pH为3.0，最适作用条件下，酶活性达到5600U/ml。中国专利CN 105316239A公开了经复合诱变筛选得到的一株产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉(A.usamil)801-2菌株，保藏号为CCTCC NO：M 2013601该菌株发酵液酸性蛋白酶酶活可达13000-14000U/mL。中国专利CN 105199969 A公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TP-235，保藏编号CGMCC 10789，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852U/ml。

综上所述，目前酸性蛋白酶产酶菌株主要是通过自然诱变结合大规模筛选得到的，其改造针对性差，工作量大，效率低已成为制约酸性蛋白酶进一步提高表达水平，降低生产成本的重要瓶颈。因此，通过基因工程手段高效的对酸性蛋白酶菌株进行改造，构建更高水平的表达菌株对进一步推进酸性蛋白酶的广泛应用，提高市场竞争力具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种构建酸性蛋白酶重组黑曲霉表达菌株的方法。

本发明还提供了一种酸性蛋白酶重组表达载体。

本发明还提供了该重组表达菌株的液体发酵工艺。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含酸性蛋白酶基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含酸性蛋白酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记等元件的基因片段。

所述的酸性蛋白酶基因为曲霉、或青霉属来源酸性蛋白酶基因；优选为白曲霉来源酸性蛋白酶基因；更进一步优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述的宿主细胞为黑曲霉。

启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。

与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’UTR)，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。

为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在黑曲霉中常用的信号肽序列有糖化酶信号肽，酸性淀粉酶信号肽，黑曲霉植酸酶信号肽，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，在本发明中利用的是酸性蛋白酶基因序列本身编码的信号肽。

优选的终止子从如下酶的基因获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

特定的基因在与启动子，调控序列，信号肽序列及终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla(糖化酶)，amya(中性淀粉酶)，amyb(中性淀粉酶)，aa(酸性淀粉酶),agda(α葡萄糖苷酶)，agdb(α葡萄糖苷酶)。

所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞或菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS或hyg。

所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记(负选择标记)连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶),hsvTK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。

所述的表达盒优选核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的表达盒通过常规方法导入随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。

所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa,α葡萄糖苷酶agda，α葡萄糖苷酶agdb。

所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。

按照本发明所述的方法构建的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株。

一种重组表达载体，包含所述的含有酸性蛋白酶基因的表达盒。

本发明所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。

一种生产酸性蛋白酶的方法，将所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株种子液按照接种量10％的比例接入发酵罐培养基，初始pH 5.5、35℃、风量1:1.2vvm、转速300-600rpm，当pH低于5.5时，开始通氨，并不断添加补料培养基来控制pH在5.5，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为120-140h；所述发酵罐培养基质量体积比组成为：淀粉8％，豆饼粉4％，硫酸铵1％，KH2PO4 0.3％，玉米浆1.2％，CaCl2 0.5％，调节pH至5.5,121℃灭菌30min；所述补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉20％，硫酸铵1％，KH2PO40.1％，玉米浆1％，CaCl2>

本发明的有益效果

本发明通过基因工程的手段，构建了酸性蛋白酶的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了酸性蛋白酶的高效分泌表达，获得了高产酸性蛋白酶黑曲霉表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵表达水平可达25000-26000U/ml。

附图说明

图1pHphtk质粒图谱

图2pepB-pHphtk质粒图谱

具体实施方法

实施例1 pHphtk质粒的构建

该质粒包含以下3部分，由南京金斯瑞生物科技有限公司构建完成，质粒图谱见图1。

(1)pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段；

(2)hyg基因表达盒，序列见SEQ ID NO.2；

(3)Hsv-tk表达盒，序列见SEQ ID NO.3。

将pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段，hyg基因表达盒，序列见SEQID NO.2以及Hsv-tk表达盒，序列见SEQ ID NO.3，三个基因片段序列片段通过GibsonMaster Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到重组质粒pHphtk。

实施例2 pepB-pHphtk质粒的构建

将白曲霉酸性蛋白酶表达盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以进行表达，使用糖化酶启动子和糖化酶终止子。构建酸性蛋白酶整合表达质粒pepB-pHphtk。白曲霉来源的酸性蛋白酶序列pepB(SEQ ID NO.1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。整合质粒构建方法如下：将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；以黑曲霉(购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC2462)基因组为模板，通过Gla-5'-F和Gla-5'-R，Gla-3'-F和Gla-3'-R分别扩增糖化酶基因侧翼5'和3'序列，每个片段长2000bp。利用PepB-F和PepB-R扩增白曲霉酸性蛋白酶序列PepB(SEQ ID NO.1)。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5'片段(SEQ ID NO.4)、3'(SEQ ID NO.5)片段和PepB片段通过GibsonMaster Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到整合质粒pepB-pHphtk，该整合质粒包含酸性蛋白酶PepB表达盒，该表达盒包含了黑曲霉糖化酶启动子序列，白曲霉来源的酸性蛋白酶序列pepB以及黑曲霉糖化酶终止子序列(SEQ ID NO.6)，经测序确认序列，质粒图谱见图2。

引物名称引物序列(5’→3’)vector-Fgtacagtgaccggtgactctttctggcatgvector-RgatgcattcgcgaggtaccgagctcGla-5'-FtcggtacctcgcgaatgcatcctaccaatgctctcgaggattgccGla-5'-RcggttttgctgaagacgaccattgctgaggtgtaatgatgctgggGla-3'-FgggcttcgctgctcaagcctagacaatcaatccatttcgctatagttaaaggatGla-3'-Ragaaagagtcaccggtcactgtacatggccaatgtggtagccgttat

实施例3 酸性蛋白酶表达盒的转化整合

本实施例出发菌株为AND4L，是由CICC2462菌株经敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因后获得的。黑曲霉中上述基因敲除/敲入方法可参考专利CN103937766A或CN 104962594A实施例中公开的技术方法实现。本实施例中pepB整合到糖化酶基因座中与CN 104962594A实施例使用相同方法实现，即参照Delmas(Appl EnvironMicrobiol.2014,80(11):3484-7)等人描述的方法。具体地，利用环状DNA载体，包含有agdB5’及3’侧翼序列，选择标记，反向选择标记(或称为负向选择标记)，以及大肠杆菌复制序列。将环状载体转入到黑曲霉中，通过正向选择获得重组菌株，再经过反向选择标记获得基因敲除/敲入菌株。

采用原生质体转化法将pepB-pHphtk质粒导入黑曲霉菌株AND4L，具体操作步骤如下：原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；NaCl 0.2％；蔗糖3％；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体。通过mira-cloth(Calbiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7M NaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH5.8)中，30℃，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm，4℃温和离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1M D-Sorbitol、50mM CaCl₂、10mM>

将环状pepB-pHphtk质粒10μl(浓度为：100ng/μl)加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min；然后分3次共加入900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于1ml STC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的TB3培养基(酵母浸膏0.3％、酸水解酪蛋白0.3％、蔗糖20％、琼脂0.7％)混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的TB3固体培养基(琼脂1％，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ng/μl潮霉素的TB3固体培养基上，34℃恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取整合转化子基因组DNA，最后对整合转化子基因组DNA进行PCR鉴定，鉴定引物为Pep-5test-F与Pep-5test-R、Pep-3test-F与Pep-3test-R，PCR产物经测序后确认整合到糖化酶基因座。将确认的阳性转化子挑取适量碎菌丝放于含1ml无菌水的离心管中，涡旋振荡使之形成菌丝悬液，取100μl涂布于含10μM 5-F2dU(5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷，厂家：Sigma)的TB3固体平板上，34℃恒温培养4-5天，即有敲除转化子长出。转化子在10μM 5-F2dU平板上传两代(防止转化子不纯)后，在300ng/μl潮霉素平板上应不能生长；然后对敲除转化子基因组DNA进行PCR鉴定，引物序列及基因组提取方法同上。使用Pep-5test-F和Pep-3test-R进行PCR鉴定，阳性转化子产物应为5.5kb，而阴性转化子为6.3kb。阳性转化子经PCR产物测序后确认后得到重组表达菌株。

引物名称引物序列(5’→3’)Pep-5test-FaatcgtgtccgcagatgtacttcacPep-5test-RgggagtcaggtactcctcatcattgPep-3test-FtgatgtgttcctgaagagccagtacPep-3test-Raactcgaacagtgtaggtgcaatgtc

实施例4 重组表达菌组液体发酵生产酸性蛋白酶

斜面培养：将所述黑曲霉重组表达菌株取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，35℃下恒温培养60h；

摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始pH5.5、35℃、摇床转速200rpm条件下培养60h。

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量10％的比例接入种子罐培养基，在初始pH5.5、35℃、转速300-600rpm条件下培养48h。

发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量10％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH 5.5、35℃、风量1:1.2vvm、转速500rpm，当pH低于5.5时，开始通氨，并不断添加补料培养基来控制pH在5.5，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为120-140h。下表是50L发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为25523U/mL。

批次发酵周期(h)发酵酶活(U/mL)112025460212524880313725100414026120513025500613626080

所述斜面培养基如下：蔗糖20g，NaNO₃>4>4>2HPO₄>

所述摇瓶种子培养基如下：麦芽汁200mL，豆饼粉5g，调节pH至5.5,121℃灭菌20min，备用；所述种子罐培养基质量体积比组成为：淀粉5％，KH₂PO₄>2>

所述发酵罐培养基质量体积比组成为：淀粉8％，豆饼粉4％，硫酸铵1％，KH₂PO₄0.3％，玉米浆1.2％，CaCl₂>

所述补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉20％，硫酸铵1％，KH₂PO₄>2>

序列表

<110>南京百斯杰生物工程有限公司

<120>高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用

<160>6

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1339

<212>DNA

<213>白曲霉(Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn)

<400>1

atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc gttctgggtc tgtccaccgc cgtctctgcg60

gcaccggctc ccactcgcaa gggcttcacc atcaaccaga ttgcccggcc tgccaacaag 120

acccgcacta tcaacctgcc gggtatgtat gcccgctcct tggccaagtt tggcggtgcg 180

gtgccccaga gcgtgaagga ggctgccagc aagggtagtg ccgtgaccac gccccagaac 240

aatgatgagg agtacctgac tcccgtcact gtcggaaagt ccacccttca tctggacttt 300

gacaccggat ctgcagatct gtgagcttcc ctgctagtat gtcctcacga actgtcacta 360

acctgtacca gctgggtctt ctcagacgag ctcccttcct cggaacggac cggtcacgat 420

gtgtacacgc ctagctccag cgcgaccaag ctgagcggct actcttggga catttcctac 480

ggtgacggca gctcggccag cggagacgtg taccgggata ctgtcaccgt cggcggtgtc 540

accaccaaca agcaggccgt tgaagctgcc agcaagatca gctccgagtt cgttcaggac 600

acggccaatg atggtcttct gggactagcc ttcagctcca tcaacactgg tgagtagatc 660

ctacatcagc tgggtgacct atttgctaac cgatacacag tccagcccaa ggcgcagacc 720

accttcttcg acaccgtcaa gtctcagctg gactctcctc ttttcgccgt gcagctgaag 780

cacgacgccc ccggtgtcta cgactttggc tacatcgatg actccaagta caccggttcc 840

atcacctaca cagatgccga tagctcccag ggctactggg gcttcaatcc cgatggctac 900

agcatcggcg acagcagctc cagctccagt ggattcagtg ccattgctgg taagaacccc 960

tttgagattt tcttgctttt tctttactga ttagtgtaca gacaccggta ccaccctcat1020

cctcctcgac gacgagatcg tctccgccta ctatgagcag gttgatggcg cccaggagag1080

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catcggcgac tacaaggccg tcgttcctgg aaagtacatc aactacgctc ccatttcgac1200

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gggtgatgtg ttcctgaaga gccagtacgt ggtattcaac tctgagggtc ctaagctggg1320

cttcgctgct caagcctag 1339

<210>2

<211>2515

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gtacagtgac cggtgactct ttctggcatg cggagagacg gacggacgca gagagaaggg60

ctgagtaata agccactggc cagacagctc tggcggctct gaggtgcagt ggatgattat 120

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caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt actcgccgat1860

agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagtgatt taatagctcc1920

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agcttagcag agctattttc attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa2100

gagacctacg agactgagga atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa2160

ttgtactttg acatgctcct cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac2220

cagccctggg ttcgcaaaga taattgcatg tttcttcctt gaactctcaa gcctacagga2280

cacacattca tcgtaggtat aaacctcgaa atcattccta ctaagatggt atacaatagt2340

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<210>3

<211>1979

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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ggtgttgcta gggagcgtcg tgttctacaa ggccagacgt cttcgcggtt gatatatatg 240

tatgtttgac tgcaggctgc tcagcgacga cagtcaagtt cgccctcgct gcttgtgcaa 300

taatcgcagt ggggaagcca caccgtgact cccatctttc agtaaagctc tgttggtgtt 360

tatcagcaat acacgtaatt taaactcgtt agcatggggc tgatagctta attaccgttt 420

accagtgccg cggttctgca gctttccttg gcccgtaaaa ttcggcgaag ccagccaatc 480

accagctagg caccagctaa accctataat tagtctctta tcaacaccat ccgctccccc 540

gggatcaatg aggagaatga gggggatgcg gggctaaaga agcctacata accctcatgc 600

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gacagcagct ccagctccag tggattcagt gccattgctg gtaagaaccc ctttgagatt1620

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tattgctgga atgtcggggc cagttggc 2548