奶牛腐蹄病的蛋白质组学和代谢组学研究

摘要

腐蹄病是一种主要由坏死梭杆菌、节瘤拟杆菌及其他病原微生物单一或混合感染的高接触性传染病，又称指（趾）间蜂窝织炎，主要侵害指（趾）间皮肤及深层软组织，引起急性或亚急性炎症。患病奶牛皮肤常坏死、裂开，炎症从指（趾）间皮肤蔓延到蹄冠、系部和球节，病肢明显跛行，并伴有全身性征候。腐蹄病是奶牛肢蹄病中危害性极为严重的一类疾病，造成奶牛食欲减退，泌乳量下降，繁殖能力降低，病情严重者将被迫淘汰，这些问题严重影响着奶牛业的健康发展，导致重大经济损失，因此，开展奶牛腐蹄病的发病机理研究，为早期诊断、防治和预防该病，具有重要的理论价值和现实意义。
　　本实验在黑龙江某牛场开展奶牛腐蹄病流行病学调查，通过PCR诊断收集50头腐蹄病奶牛血浆样本，同时采集50头健康奶牛血浆样品作为对照组，开展奶牛血液理化指标检测，从中分别选择18头腐蹄病奶牛和健康奶牛进行蛋白质组学和代谢组学实验，结果如下:
　　1、在黑龙江某集约化牛场，调查奶牛腐蹄病的发病情况及其与年龄、胎次、泌乳量及季节的关系，并对实验牛血浆Na、K、Ca、Mg、P、Cu、Zn、VE、VH、SOD、MAD、GSH-PX等指标进行检测。
　　结果:
　　(1)该牛场腐蹄病发病率为2.99％，占肢蹄病患病的13.91％;
　　(2)年龄和胎次与腐蹄病的发生呈负相关，与泌乳量呈正相关，多发于晚春、整个夏季及早秋;
　　(3)与健康奶牛相比，腐蹄病奶牛血浆Na、Mg、Zn、VE、VH、SOD和GSH-PX含量极显著降低(P＜0.01)，血浆K、Cu和MDA含量极显著升高(P＜0.01)。
　　2、根据实验奶牛临床理化指标检测结果，进行Pearson相关性分析和回归分析。
　　结果:
　　(1)血浆Na(R=0.893，P=0.000)、Mg(R=0.748，P=0.000)、Zn(R=0.451，P=0.000)、VE(R=0.848，P=0.000)、SOD(R=0.640，P=0.000)和GSH(R=0.766，P=0.000)水平与奶牛腐蹄病呈显著正相关;血浆K(R=-0.798，P=0.000)、Cu(R=-0.655，P=0.000)、VH(R=-0.545，P=0.000)和MDA(R=-0.267，P=0.007)水平与腐蹄病发生呈显著负相关。
　　(2)经回归分析确定血浆Na，K，VE和GSH指标可以作为奶牛腐蹄病发生的风险因素。
　　3、选取健康奶牛及腐蹄病奶牛各18头分为对照组（C组）和患病组（T组），采集血浆样本进行双向凝胶电泳分离蛋白，应用DeCyDer软件进行差异分析筛选差异蛋白。然后，将所选取的差异蛋白进行MALDI-TOF-MS质谱分析，再结合NCBI数据库搜索，鉴定差异蛋白。最后，应用对差异蛋白进行Networks分析、GO分析和Pathway分析。
　　结果:
　　(1)获得腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白2D电泳图谱，运用质谱技术和生物信息学技术鉴定出11种腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白。
　　(2)与对照组比较，腐蹄病组表达上调的蛋白分别为Ig、MapK、FG、HP。表达下调的蛋白分别为HP25、Fb、EALB、RB、ALB、AppA、CB，应用WesternBlotting验证了FG蛋白表达上调。
　　(3)通过Networks分析、GO分析和Pathway分析和搜索，发现这些蛋白参与机体炎症反应、细菌感染、免疫应答等病理生理过程。
　　4、对C组和T组奶牛血浆样品进行1H NMR检测，对比其血浆代谢组学图谱，进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA等多元统计分析，筛选及鉴定腐蹄病奶牛血浆差异代谢产物，并进行生物信息学分析。
　　结果:
　　(1)与C组相比，T组奶牛血浆共21种代谢物表现异常，包括表达上调的G1，But，Lac，以及表达下降的IBut，Eth，Ace，Ala，Acet，Car，Pyr，Sar，Suc，Bet，Cre，Etg，Gly，Glu，Gle，Ser，Val，πHis。其中呈显著性变化的包括Pyr、Sar、Suc、Lac和Val。这些代谢物与糖代谢、氨基酸代谢、脂蛋白代谢异常密切相关。
　　(2)差异代谢物代谢通路的拓扑分析共映射至28条血浆代谢通路。其中参与腐蹄病奶牛机体代谢变化的通路主要有丙酮酸代谢通路、氨酰tRNA生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油脂代谢通路、甲烷代谢通路、丁酸代谢通路、酮体合成和降解、糖酵解或糖异生通路和TCA循环通路。
　　5、根据生物信息学结果构建腐蹄病奶牛血浆代谢物和蛋白质相互作用网络。
　　结果:
　　(1)CB和MapK两个差异表达蛋白结果表明，奶牛感染坏死杆菌后极易引起其他病原菌继发感染，尤其是沙门氏菌、螺杆菌和葡萄球菌感染;
　　(2)腐蹄病奶牛机体炎症反应使胰岛素分泌、胰岛素抵抗及胰岛素信号通路3个生理机制激活或影响其功能发挥，致使三大物质代谢发生紊乱;
　　(3)差异表达蛋白涉及到白细胞转运调节、TNF信号调节、NF-KAPPAB信号通路和MapK信号通路等。这些代谢通路与奶牛机体炎症反应通路间接的上下游关系;
　　(4)MapK蛋白存在于破骨细胞分化的信号通路中，而破骨细胞降解的信号通路属于炎症反应的下游通路，推测为炎症反应激活破骨细胞分化，促发蹄部骨组织吸收。
　　结论:
　　本实验首次应用2DE/MALDI-TOF-MS和1H NMR技术筛选、鉴定腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白（11种）和代谢物（21种），通过生物信息学分析揭示了这些蛋白参与机体炎症反应、补体通路、凝血过程等多个生理和病理过程，应用1H NMR技术结合多元统计分析能够有效的筛选出腐蹄病奶牛血浆差异代谢产物，全景式、动态性地阐明了奶牛发生腐蹄病时体内代谢紊乱状态，丰富了奶牛腐蹄病“组学”理论，为深入研究和解析奶牛腐蹄病的发生发展机制提供了理论和方法学基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 奶牛腐蹄病的研究现状

1．1．1 奶牛腐蹄病病因

1．1．2 腐蹄病临床症状

1．1．3 腐蹄病病理学

1．1．4 奶牛腐蹄病诊断

1．1．5 奶牛腐蹄病预防

1．1．6 奶牛腐蹄病治疗

1．2 蛋白质组学研究进展

1．2．1 蛋白质组学概念

1．2．2 蛋白质组学研究内容

1．2．3 比较蛋白质组学主要研究技术

1．2．4 比较蛋白质组学在动物医学领域研究进展

1．3 代谢组学研究进展

1．3．1 代谢组学概念

1．3．2 代谢组学研究内容

1．3．3 代谢组学在动物医学领域研究进展

1．4 研究目的与意义

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究目的

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验仪器和试剂

2．1．3 实验应用软件

2．2 实验方法

2．2．1 奶牛腐蹄病的发病情况调查

2．2．2 奶牛腐蹄病的PCR诊断

2．2．3 实验奶牛的临床理化指标检测

2．2．4 奶牛腐蹄病的风险因素分析

2．2．5 腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白的筛选、鉴定及生物信息学分析

2．2．6 腐蹄病奶牛血浆差异代谢物的筛选、鉴定及代谢通路归属分析

3 实验结果与分析

3．1 腐蹄病流行病学调查结果

3．1．1 腐蹄病发病情况

3．1．2 年龄与胎次

3．1．3 泌乳量

3．1．4 发病季节

3．1．5 奶牛年龄、胎次、泌乳量与腐蹄病的相关性

3．2 奶牛腐蹄病的PCR诊断结果

3．2．1 采集蹄部拭子的PCR鉴定结果

3．2．2 病原茵革兰氏染色、镜检的结果

3．3 实验奶牛的临床理化指标检测结果

3．3．1 腐蹄病奶牛血浆矿物元素检测结果

3．3．2 腐蹄病奶牛血浆微量元素和维生素检测结果

3．3．3 腐蹄病奶牛血浆氧化应激指标检测结果

3．4 奶牛腐蹄病的风险因素分析

3．4．1 血浆矿物元素风险因素分析

3．4．2 血浆微量元素和维生素风险因素分析

3．4．3 血浆氧化应激指标风险因素分析

3．4．4 奶牛腐蹄病风险因素的确定

3．5 实验奶牛血浆差异表达蛋白的筛选、鉴定及生物信息学分析结果

3．5．1 2DE凝胶电泳图谱

3．5．2 MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果

3．5．3 生物信息学分析结果

3．5．4 免疫印迹实验结果

3．6 差异表达代谢物的筛选、鉴定及代谢通路归属分析结果

3．6．1 实验奶牛血浆1H NMR图谱

3．6．2 PCA分析结果

3．6．3 PLS-DA模型的建立和排列验证

3．6．4 OPLS-DA模型建立和代谢物相关性分析结果

3．6．5 血浆代谢通路的变化

3．6．6 差异蛋白质和代谢物互作网络的构建

4 讨论

4．1 奶牛腐蹄病的流行病学状况

4．1．1 腐蹄病的发病情况

4．1．2 年龄、胎次、泌乳量对腐蹄病的影响

4．1．3 不同季节对腐足帝病的影响

4．2 腐蹄病奶牛临床理化指标的变化

4．2．1 腐蹄病奶牛血浆矿物元素的变化

4．2．2 腐蹄病奶牛血浆微量元素和维生素的变化

4．2．3 腐蹄病奶牛血浆氧化应激指标的变化

4．3 奶牛腐蹄病血浆蛋白质组学轮廓分析

4．3．1 表达上调的蛋白

4．3．2 表达下调的蛋白

4．4 应用2DE／MALDI-TOF-MS技术分离和鉴定腐蹄病奶牛血浆差异表达蛋白

4．5 奶牛腐蹄病血浆代谢组学轮廓分析

4．5．1 氨基酸代谢异常

4．5．2 碳水化合物代谢异常

4．5．3 脂代谢异常

4．6 奶牛腐蹄病的“组学’’机制

4．6．1 腐蹄病与细菌感染

4．6．2 腐蹄病与机体物质代谢

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文