嗜热链球菌KLDS SM基因组学分析及比较基因组学分析

摘要

嗜热链球菌是“公认安全性（GRAS）”菌株，被广泛应用于一些重要发酵乳制品的工业生产中，是继乳酸乳球菌之后的第二个重要的工业用乳酸菌物种，市场价值约400亿美元。由于分子生物学研究手段的限制，传统的微生物研究多集中于根据生理生化试验及分子生物学实验研究菌株某些性能以及形成机制，研究范围限于单个基因的功能，或者少数几个基因之间的相互作用，而且需要大量的人力及物力。随着测序技术逐渐成熟、成本的降低，微生物基因组测序变得普及使得研究人员可以从生物信息的方法分析和预测生物的遗传学特征和功能，如基因的功能、多基因之间的相互作用、生理生化代谢途径、基因的表达调控，并设计出针对性更高的实验方案，节约科研成本。为了从遗传角度上更加深入的分析与评价具有自主知识产权的快速产酸、高产黏的嗜热链球菌KLDS SM应用于乳制品发酵的性能，同时挖掘该菌株的潜在功能，本研究对嗜热链球菌KLDS SM进行了全基因测序，绘制基因组图谱。利用COG与KEGG数据库对编码的蛋白进行了注释，使用生物信息分析软件与方法从基因组水平上详细分析了菌株KLDS SM的环境适应性（糖代谢、蛋白质水解系统、胁迫应答、双组份系统、协同作用、基因组岛、假基因）、生物合成（胞外多糖、氨基酸、B族维生素）及防御系统（CRISPR/Cas系统、限制修饰系统、细菌素）三个方面。同时与NCBI公布的已完成全基因组测序的14株嗜热链球菌进行比较，重点分析了菌株KLDS SM在胞外多糖、氨基酸与B族维生素的合成及CRISPR/Cas系统4个方面的潜力以及其潜在特有的功能。最后对菌株KLDS SM在遗传上表现优异的功能进行了初步的实验验证，并且测定了该菌同保加利亚乳杆菌组合发酵与单菌发酵EPS产量。
　　本研究主要内容包括：⑴菌株KLDS SM的基本特征分析。KLDS SM基因组由一个1，856，787 bp环状染色体组成，GC含量为39.08％。共预测到1，950个基因，其中1，732个蛋白编码基因，129个假基因，6个rRNA操纵子，67个tRNA基因及4个ncRNA基因。分别有1，400个与1，046个蛋白编码基因注释到COG数据库及KEGG数据库中。⑵菌株KLDS SM的环境适应性分析。该菌株能够转运且利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖与β-葡萄糖苷，经糖酵解途径生成L-乳酸，但不具有完整的柠檬酸途径及磷酸戊糖途径;有完整的蛋白水解系统;可编码多个与胁迫相关的蛋白，且多与酸、氧与热胁迫有关;有4组完整且具有功能的TCS，参与调解自身细菌素的合成及生物膜的形成等过程;预测出9个基因组岛多与生物合成、代谢、防御、转运与转录调节相关;蛋白编码基因中假基因占6.9％，与糖类的转运、代谢及氨基酸的合成、转运等方面有关。⑶菌株KLDS SM的生物合成分析。该菌具有一个同高产胞外多糖的菌株ASCC1275高度一致(99％ identity)的胞外多糖基因簇，初步测定胞外多糖的产量约331 mg/L;其可合成His、Trp、Ser、Cys、Gly、 Val、Leu与Ala8种氨基酸，其中Val、Leu、Trp为人体必需氨基酸，且15株菌的氨基酸合成能力相对保守;可从头合成叶酸，但无法合成其他B族维生素，15株菌的B族维生素生物合成能力差异不大。⑷菌株KLDS SM的防御系统。该菌有4个CRISPR/Cas系统，预测CRISPR位点的活性由强到弱为CRISPR1＞CRISPR4＞CRISPR3＞CRISPR2，而位点2的CRISPR/Cas系统发生了退化;R-M系统并不丰富，仅有2个完整的Ⅰ型R-M系统;基因组中存在2个细菌素合成的基因簇，但合成羊毛硫抗生素的基因簇发生了退化。⑸与15株嗜热链球菌的比较基因组分析。基因组之间具有非常保守的同线性，泛基因组由4，094个基因组成且呈开放型，核心基因组由1，240个基因组成。菌株KLDS SM与菌株MN-BM-A02、菌株ASCC1275、菌株ND07三者的亲缘关系最近，与菌株LMG18311、菌株CNRZ1066亲缘关系较远。⑹单菌、组合发酵EPS产量的比较结果表明，组合发酵均较单菌发酵产EPS多。在发酵4-8 h时，KLDS SM与KLDS08007组合发酵产生EPS的速率最快，速率约为18.9mg/L·h，且最终产生的EPS最多，约为158mg/L。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 嗜热链球菌概述

1．2．2 基因组学与比较基因组学

1．2．3 乳酸菌环境适应性

1．2．4 乳酸菌的生物合成

1．2．5 乳酸菌的防御系统

1．3 研究的目的及意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

1．4 主要研究内容

1．5 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的活化及基因组提取

2．2．2 KLDS SM全基因组测序及组装

2．2．3 基因组注释

2．2．4 生物信息分析

2．2．5 EPS产量测定

2．2．6 数据处理

3 结果与分析

3．1 基因组的基本特征及注释

3．1．1 测序及组装

3．1．2 基因组的基本特征

3．1．3 COG与KEGG注释

3．2 环境适应能力

3．2．1 糖代谢过程

3．2．2 蛋白质水解系统

3．2．3 抗逆能力

3．2．4 双组份系统

3．2．5 协同作用

3．2．6 基因组岛

3．2．7 假基因

3．3 生物合成

3．3．1 EPS的生物合成

3．3．2 氨基酸的生物合成

3．3．3 B族维生素的生物合成

3．4 防御系统

3．4．1 CRISPR／Cas系统

3．4．2 限制修饰系统

3．4．3 细菌素

3．5 比较基因组分析

3．5．1 共线性分析

3．5．2 泛基因组与核心基因组分析

3．5．3 系统发育树

3．5．4 特异基因分析

3．6 EPS产量测定

3．6．1 菌株KLDS SM EPS产量初步测定

3．6．2 单菌、组合发酵EPS的产量测定

4 讨论

4．1 菌株KLDS SM环境适应

4．2 菌株KLDS SM的生物合成

4．3 菌株KLDS SM的防御系统

4．4 菌株KLDS SM基因组的比较分析

4．5 单菌、组合发酵EPS的差异

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文