三种牛干扰素融合蛋白的制备及其生物学活性鉴定

摘要

干扰素(Interferon，IFN)作为一种具有抗病毒和免疫调节作用的糖蛋白，常用于治疗和预防病毒性疾病，但干扰素的半衰期短，治疗疾病过程中需反复注射并且会伴随细胞毒性的副反应发生，这些劣势极大地限制了其在临床上的应用。因此，探索性研制低毒、长效性干扰素具有重要意义。
　　本研究中，为延长牛干扰素α(Bovine Interferon-α，BoIFNα)的半衰期并降低其细胞毒性，利用免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG，IgG)具有半衰期长的特性，构建了BoIFNα与牛IgG重链恒定区（Bovine ImmunoglobulinγChian Costont Region，BoIgCγ）的重组融合蛋白BoIFNα-IgCγ;利用牛干扰素τ(Bovine Interferon-τ，BoIFNτ)具有细胞毒性低的特性，构建了BoIFNα（成熟肽氨基端前163个氨基酸）和BoIFNτ（成熟肽羧基端后10个氨基酸）的重组杂合蛋白BoIFNα/τ;同时，构建了BoIFNα/τ和BoIgCγ的重组融合蛋白BoIFNα/τ-IgCγ，期望其具有长效低毒的双重作用。利用大肠杆菌原核表达系统实现了三种干扰素融合蛋白的表达，并进行了理化性质和生物学活性研究。分别对三种干扰素融合蛋白在MDBK细胞上进行毒性研究，在BALB/c小鼠、SD大鼠和荷斯坦牛50％血浆中进行体外半衰期研究，在SD大鼠体内进行半衰期研究。
　　研究表明，三种干扰素融合蛋白在MDBK/BT/PK-15/F81/RK-13-VSV系统中均具有抗病毒活性，抗病毒活性由高至低依次为BoIFNα、BoIFNα/τ、BoIFNα-IgCγ及BoIFNα/τ-IgCγ，在BHK-21/MDCK-VSV两种系统上无抗病毒活性;在MDBK细胞上也具有抗BEV、BPIV3的活性。三种干扰素融合蛋白对胰酶高度敏感，耐高温和酸碱环境，但相对于BoIFNα，BoIFNα-IgCγ和BoIFNα/τ-IgCγ对酸性环境和高温环境更敏感。毒性研究表明，三种干扰素融合蛋白均能抑制MDBK细胞的生长并呈剂量依赖性，细胞毒性由弱至强为BoIFNα/τ、BoIFNα/τ-IgCγ、BoIFNα、BoIFNα-IgCγ。体外半衰期研究显示，在BALB/c小鼠、SD大鼠和荷斯坦牛50％血浆中，BoIFNα-IgCγ半衰期（约24h）显著长于BoIFNα的半衰期（约12h）。SD大鼠体内半衰期实验结果显示，注射高低两种剂量的BoIFNα-IgCγ在血浆中发挥抗病毒作用时间分别是BoIFNα的1.4倍和2倍，BoIFNα-IgCγ、BoIFNα/τ-IgCγ在血浆中发挥抗病毒作用时间均长于BoIFNα和BoIFNα/τ。总之，本研究为长效及低毒牛干扰素的研发及临床应用做出了有意义的探索。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．4 IFN-τ家族概述

1．1．5 干扰素应用

1．2 免疫球蛋白概况

1．2．1 免疫球蛋白结构及分类

1．2．2 免疫球蛋白G结构特点及生物学功能

1．2．3 免疫球蛋白G应用

1．3 人工修饰干扰素与干扰素融合蛋白

1．3．1 长效干扰素

1．3．2 杂合干扰素

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 质粒、宿主菌、动物

2．1．2 细胞、病毒、血清

2．1．3 抗体、试剂、仪器

2．2 方法

2．2．1 三种干扰素融合蛋白实验设计

2．2．2 牛IgG恒定区的克隆

2．2．3 干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

2．2．4 干扰素融合蛋白表达及纯化

2．2．5 BoIFNα、BoIFNα／τ多克隆抗体制备及Western Blot鉴定

2．2．6 干扰素融合蛋白抗病毒活性测定

2．2．7 干扰素融合蛋白理化性质测定

2．2．8 干扰素融合蛋白细胞毒性测定

2．2．9 干扰素融合蛋白体外半衰期测定

2．2．10 干扰素融合蛋白体内半衰期测定

2．2．11 统计分析

3 结果与分析

3．1 牛IgG恒定区的克隆

3．1．1 牛IgG恒定区的PCR扩增

3．1．3 BoIgCγ基因的序列分析

3．2 干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

3．2．2 pET32a-BoIgCγ原核表达载体的构建

3．2．3 pET30a-BoIFNα-IgCγ原核表达载体的构建

3．2．4 pET32a-BoIFNα／τ原核表达载体的构建

3．2．5 pET32a-BoIFNα／τ-IgCγ原核表达载体的构建

3．2．6 pET30a-BoIFNα-IgγFc原核表达载体的构建

3．3 干扰素融合蛋白表达及纯化

3．4 BoIFNβ、BoIFNα／τ多克隆抗体制备及Western Blot鉴定

3．5 干扰素融合蛋白抗病毒活性分析

3．5．1 干扰素融合蛋白在不同细胞上抗VSV活性测定

3．5．2 干扰素融合蛋白抗牛源病毒活性测定

3．6 干扰素融合蛋白理化性质分析

3．6．1 胰酶敏感性测定

3．6．2 酸碱敏感性测定

3．6．3 温度敏感性测定

3．7 干扰素融合蛋白细胞毒性分析

3．8 干扰素融合蛋白体外半衰期分析

3．8．1 BALB／c小鼠50％血浆稳定性测定

3．8．2 SD大鼠50％血浆稳定性测定

3．8．3 牛50％血浆稳定性测定

3．9 体内血浆剩余干扰素活性分析

4 讨论

4．1 重组干扰素在大肠杆菌中的表达

4．2 干扰素融合蛋白的研究

4．3 三种干扰素融合蛋白理化性质

4．4 三种干扰素融合蛋白抗病毒活性

4．5 三种干扰素融合蛋白细胞毒性测定

4．6 三种干扰素融合蛋白半衰期测定

4．7 干扰素融合蛋白应用前景

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文