重组鸡Leptin融合蛋白的制备及其生物学活性的检测

摘要

将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSETA的NheⅠ和HindⅢ两位点之间,构建重组表达质粒pLepSCAU2并转化Ecoli.BL21(DE3).PCR扩增、酶切鉴定和序列测定证明了构建和阅读框架的正确性.转化含有pLepSCAU2的Ecoli.BL21(DE3)菌株在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中培养至OD600大于0.6之后,经IPTG诱导表达出分子量约为17.5kDa的蛋白,在IPTG浓度为0.05mol/L时诱导4h表达最高,占总菌体蛋白的25﹪左右.表达的重组蛋白经50﹪Ni-NTA树脂纯化后经透析复性折叠后,对34日龄的矮脚黄鸡(共20只,公母各半)腹腔注射(2mg/kg体重).Leptin处理鸡在注射后60min内的累加采食量与用PBS注射的对照组的采食量的差异不显著(p＞0.05);在注射后80～120min处理组(公鸡和母鸡)的累加采食量都显著低于对照组(p＜0.05).Leptin处理公鸡的采食量在注射2h后逐渐上升并在5.5h时与对照组公鸡相同.但Leptin处理对母鸡采食的抑制则一直维持,使处理组的累加采食量在注射后5.5h后仍然显著低于对照组母鸡(p＜0.01).这些结果表明所表达的鸡Leptin融合蛋白能显著降低生长鸡的采食量,效果在母鸡比公鸡更为明显,从而也证明了所制备的Leptin融合蛋白具有生物学活性,这些工作为今后研究Leptin对禽类繁殖和其他生理活动的调控打下了基础.