一种牛干扰素α生物学活性检测方法

摘要

本发明公开了一种牛干扰素α生物学活性检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段；去除pEGFP‑N1载体质粒的pCMV；用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP‑N1载体质粒中的pCMV，构建pEGFP‑N1‑Mxp质粒；用pEGFP‑N1‑Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养，加入牛干扰素α与克隆化培养后的稳定转染细胞株共孵育，会激活Mx基因启动子活性促进细胞内EGFP的表达，通过激发光源照射后细胞发出荧光的强度与牛干扰素α的生物学活性呈正相关，因此可以定量评价牛干扰素α的生物学活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛干扰素α生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测技术领域。

背景技术

干扰素(IFN)是细胞和机体受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素和促细胞分裂素等的作用后，由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。根据干扰素的来源和理化性质，可将其分为I型、II型和III干扰素。I型干扰素包括IFN-α，IFN-β，和IFN-τ；II型干扰素即IFN-γ；III干扰素即IL-28A，IL-28B和IL-29。

IFN-α有四个主要功能。第一，可以使感染病毒的细胞及其周围细胞进入内源性抗病毒状态，限制病毒的传播；第二，维持天然免疫反应处于平衡状态，促进抗原递呈和NK细胞功能的同时抑制促炎信号通路和细胞因子的产生；第三，激活获得性免疫系统，促进高亲和力抗原特异性T细胞的产生，促进B细胞反应和免疫记忆；第四，具有抑制病毒增殖的作用。

IFN-α的作用机制在25年前已经阐明，IFN与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2，使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核，装配IFN调节因子9(IRF9)形成3聚体的IFN刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(IFN刺激反应元件，ISREs)结合，直接激活ISGs转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应IFN-α的生物学活性。

IFN-α可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter，Mxp)，促进Mx的表达，Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在牛中存在Mx和Mx2两种蛋白，其中Mx起主要作用。Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞介素和肿瘤坏死因子等其它细胞因子启动，能够准确反应IFN-α生物学功能。

目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法：病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，准确度低。最近Mxp-Luciferase(荧光素酶)系统已经开始用于I型干扰素生物学活性检测，该系统检测的是IFN激活Mxp的能力，不存在假阳性；整个过程完全避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；检测程序简化，时间大大缩短，在IFN处理细胞后约6h即可完成检测，检测速度快；荧光素酶的表达可以通过仪器检测精确量化，不仅提高了IFN定量的准确性，更便于大量样品的高通量操作。但该方法基于质粒瞬时转染为基础，每次需要准备内参照质粒，并保证质粒转染效率一致才能够得到准确的检测结果，因此在一般实验室很难开展，而且需要使用荧光素酶底物，增加了使用成本。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用绿色荧光蛋白(EGFP)的牛干扰素α生物学活性检测方法，该方法不需要内参照质粒，能够简化检测过程，不需要重复进行质粒转染，提高准确性和重复性，实用性更强。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种牛干扰素α生物学活性检测方法，其包括以下步骤：

采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒；

用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；

对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；

以梯度稀释的牛干扰素α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；

将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检牛干扰素α样品的效价。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，在稳定转染细胞株中加入牛干扰素α，会激活Mx基因启动子活性促进细胞内EGFP的表达，通过激发光源照射后细胞发出荧光的强度与牛干扰素α的生物学活性呈正相关，因此可以定量评价牛干扰素α的生物学活性。

本发明中，Mxp是指牛Mx基因启动子区域，pCMV是指pEGFP-N1质粒的CMV启动子区域。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，采用PCR扩增获取牛Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括：

根据Genebank中已公布的牛Mx蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增；

然后通过双酶切后，再通过切胶回收纯化获得Mxp的基因片段。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，设计PCR引物的方法为常规。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，用PCR扩增获得的牛Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒的步骤包括：

去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段；

通过T4DNA连接酶用Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建重组质粒pEGFP-N1-Mxp；

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，摇菌，提取重组质粒，通过DNA测序获得重组质粒的Mxp片段的DNA序列，选择正确序列的重组质粒；

所述序列如序列1所示。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：

通过转染试剂将pEGFP-N1-Mxp质粒转染至细胞，转染96h左右后，换成含2μg/mL左右的新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，所述克隆化培养为将筛选出的稳定转染细胞株通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，在对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养的步骤中还包括对克隆后的细胞进行检测，通过PCR鉴定细胞基因组中是否含有Mxp基因。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，Mxp的基因片段序列为序列1所示。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的方法为双酶切法。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，所述细胞为MDBK细胞(牛肾细胞)。

上述的牛干扰素α生物学活性检测方法中，优选的，所述牛干扰素α标准品为公布号为CN106319006A的专利所揭示的一种重组牛α干扰素标准品的制备方法制备得到的重组牛α干扰素。

本发明还提供上述的牛干扰素α生物学活性检测方法在对天然或重组牛干扰素α进行生物学活性检测中的应用。

本发明构建了以牛Mx基因启动子作为启动子启动EGFP表达的报告基因质粒，转染MDBK细胞，筛选稳定转染细胞株，用梯度稀释的重组牛干扰素α标准品和待检样品分别与细胞共孵育后，检测细胞中EGFP的发光值，以重组牛干扰素α标准品制备标准曲线来检测待检样品中牛干扰素α的生物学活性。该检测方法主要有以下特点：1.与传统方法相比大大缩短了检测时间(由传统的3-7天缩短至6-8小时)，省去了病毒培养或重复进行质粒转染等较繁琐的操作，只需要培养细胞即可，避免了可能存在的生物安全危害，提高了可重复性。2.与荧光素酶报告基因检测系统相比不需要使用底物，降低了成本。

本发明的突出效果为：

本发明利用绿色荧光蛋白(EGFP)代替荧光素酶构建Mxp-EGFP报告基因系统，本系统不需要内参照质粒，因此可以将Mxp-EGFP报告基因系统稳定表达于细胞中，而且由于检测技术的进步，细胞中EGFP可以定量检测。每次只需培养该细胞，并用干扰素-α处理6h后在特定的仪器下检测荧光强度即可完成干扰素活性检测，极大地简化了检测过程，缩短检测时间，提高了准确性，更具有实用性，适合在规模化生产中应用。

附图说明

图1是实施例1的pEGFP-N1-Mxp质粒构建示意图；

图2是实施例1的EGFP报告基因法标准曲线图；

图3是实施例2的EGFP报告基因法与微量细胞病变抑制检测结果的相关性比较图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明下述实施例中所用的材料如下：

MDBK细胞(ATCCNo.CCL-22)购自ATCC，VSV病毒由中国科学院武汉病毒研究所提供，真核表达载体pEGFP-N1购自Clontech公司，各种限制性内切酶、Ex-Taq酶、T4DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Takara公司，转染试剂Fugen6购自Promega公司，Opti-MEM、DMEM培养基和FBS购自Invitrogen公司，各种规格细胞培养板购自Corning公司，多功能酶标仪购自MD公司，荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；

牛干扰素α标准品(10⁷IU/mL)为公布号为CN106319006A的专利所揭示的一种重组牛α干扰素标准品的制备方法制备得到的重组牛α干扰素(选择其实施例1或2的方式)。

实施例1

本实施例提供一种牛干扰素α生物学活性检测方法，其是对重组牛干扰素α的生物学活性进行检测的一种应用，本实施例的检测方法也可以对应地用于天然牛干扰素α的活性检测，其包括如下步骤：

根据Genebank中已公布的牛Mx蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，通过酚-氯仿-异戊醇法从MDBK细胞中提取DNA作为模板，使用上述PCR引物和Ex-Taq酶进行PCR扩增(下划线部分为上下游引物位置)；

PCR扩增获得的产物经Ase I和Age I双酶切后再通过切胶回收纯化(在上游PCR引物引入Ase I酶切位点，下游PCR引物引入Age I酶切位点，其中包含的干扰素反应元件见粗体字部分)，得Mxp的基因片段，Mxp的基因片段序列为序列1所示；

采用双酶切法去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段；

通过T4DNA连接酶将上述切胶回收得到的Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1质粒中pCMV的基因片段，转化DH5α感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取质粒，通过DNA测序获得Mxp的DNA序列，选择序列正确的质粒即为pEGFP-N1-Mxp质粒，其构建示意图如图1所示。

用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株样品：采用去内毒素质粒提取试剂盒提取pEGFP-N1-Mxp质粒，取1μg质粒置于1.5mL无菌EP管中用OptiMEM培养基补足体积至500μl，轻柔混匀，室温孵育5min；取1.5mL灭菌EP管，加入5μlFugen6溶于500μl无血清Opti-MEM培养基中，轻柔混匀，室温孵育5min；将质粒溶液和转染试剂溶液轻柔混匀，室温孵育20min；用无血清Opti-MEM培养基传代培养MDBK细胞至6孔板中，每孔5×10⁵个细胞；向每孔加入质粒-转染试剂复合物，于37℃含5％CO₂培养箱中培养过夜；次日，移除培养基，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)完全培养基继续培养96h；之后改用含2μg/mL新霉素的完全培养基筛选培养14日，每2日更换一次新鲜的培养基；期间视细胞生长情况决定是否传代；在新霉素作用14日后存活的细胞即为稳定转染细胞；

将筛选获得有新霉素抗性的细胞用含0.25μg/mL嘌呤霉素的完全培养基稀释至细胞浓度为10个/mL；向96孔板中每孔加入0.1mL细胞悬液，于37℃含5％CO₂培养箱中培养；每日观察，挑选有单个克隆的孔，培养至细胞覆盖孔表面积1/3时，将细胞转移至6孔板中通过有限稀释培养法扩大培养，并通过PCR鉴定细胞基因组中是否含有Mxp基因，冻存保种，命名为MDBK-pEGFP-N1-Mxp。

取牛干扰素α标准品1mL，按照1:10、1:100、1:10³…1:10⁷的梯度用完全培养基稀释；

将0.1mL的稳定转染细胞株MDBK-pEGFP-N1-Mxp接种至96孔细胞培养板中过夜培养使细胞密度达到90％，弃去培养基；向每孔加入0.1mL用完全培养基稀释后的重组牛干扰素α标准品，每个稀释度3个平行孔，设置不加重组牛干扰素α的孔作为对照，于37℃含5％CO₂培养箱中继续培养6h，取出培养板，置于多功能酶标仪检测台上，设置激发光波长为488nm，接受波长为597nm，底光源照射。检测结果如图2所示，得到标准曲线，结果显示随着重组牛干扰素α的梯度稀释荧光强度逐渐降低，荧光强度与重组牛干扰素α标准品的稀释度的负对数呈显著的指数关系R²＝0.9943，检测范围为0.1IU-10⁷IU/mL。

将待检牛干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价得到待检牛干扰素α样品的效价。

可见使用本发明构建的检测方法不需要内参照质粒，重复性好，不被其他细胞因子影响。

实施例2

本实施例提供本发明牛干扰素α生物学活性检测方法的检测结果与微量细胞病变抑制法检测结果的对比相关性实验。

采用EGFP报告基因法和微量细胞病变抑制法检测同时检测20份重组牛干扰素α标本，通过线性回归分析两种方法的结果是否具有相关性。

EGFP报告基因法检测流程如实施例1所示。

微量细胞病变抑制法按如下操作：取牛干扰素α标本1mL，用完全培养基1:100稀释后再用完全培养基倍比稀释；将MDBK传代培养接种至96孔细胞培养板，每孔接种100μl细胞悬液(2×10⁵个/mL)；再加入不同稀释度的重组牛干扰素α100μl每孔，病毒对照和细胞对照加入100μl培养基，于37℃含5％CO₂培养箱中继续培养16h；弃去培养基，除细胞对照孔外，每孔加入100μl合适滴度的VSV(24h能使MDBK细胞完全脱落的VSV病毒滴度)，于37℃含5％CO₂培养箱中继续培养24h，显微镜下观察病毒对照孔细胞破碎达100％而细胞对照正常时，即可用结晶紫染色，水洗后肉眼观察记录，细胞对照孔中细胞完整呈紫色，病毒对照无着色(100％CPE++++)表明系统成立，在其基础上观察不同孔中着色情况，记录CPE情况，通过Reed-Muench法计算半数细胞病变抑制的稀释倍数，从而得到干扰素的效价。

结果如图3所示，两种检测方法的相关性分析显示R²＞0.9，表明两者有很高的相关性。该结果表明，本发明建立的干扰素活性检测方法简单、快捷，检测结果可靠、稳定，可以替代微量细胞病变抑制法这种传统的检测方法应用于天然或重组牛干扰素α活性测定。

综上所述，本发明实施例利用绿色荧光蛋白(EGFP)代替荧光素酶构建Mxp-EGFP报告基因系统，本系统不需要内参照质粒，因此可以将Mxp-EGFP报告基因系统稳定表达于细胞中，而且由于检测技术的进步，细胞中EGFP可以定量检测。每次只需培养该细胞，并用干扰素-α处理6h后在特定的仪器下检测荧光强度即可完成干扰素抗病毒活性检测，极大地简化了检测过程，缩短检测时间，提高了准确性，更具有实用性，适合在规模化生产中应用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

<120> 一种牛干扰素α生物学活性检测方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attaatgcca ggaacttcag aagggccgga taaagctcgg gtagctgggt cctgcgcccg 60

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