羽衣甘蓝SRK和SCR的克隆表达及克服自交不亲和性的研究

摘要

羽衣甘蓝(Brassica oleracea vat．acephala)是一种典型的孢子体型自交不亲和性(Self-incompatibilitv，SI)植物，在遗传上，羽衣甘蓝SI受具有复等位基因的S单倍型控制，并且认为S单倍型上S受体蛋白激酶(S-locus receptor kinase，SRK)和S位点富含半胱氨酸的蛋白(S-locus cysteine-rich protein，SCR)/SPll(S-loctls protein 11)分别控制着花粉(雄性)和柱头乳突细胞(雌性)的SI。本文获得了。SRK激酶域的cDNA片段、SRK表达的全长序列、SCR cDNA序列和SCR DNA序列克隆共四个克隆。确定了本试验材料9号“赤兔”自交不亲和系的基因型为S<,13b>单倍型。并进行了一些克服花粉自交不亲和性的探索性试验。得到以下结论： (1)采用Northern杂交方法确定了SRK基因只在>10mm和8-10mm长的花蕾中有表达，且>10mm花蕾的表达量大于8-10mm花蕾的表达量。 (2)分离出一种新基因SCR<,13b>，此基因与SCR<,13>序列有较高的同源性，它含有一个758 bp的内含子，编码一个由78个氨基酸组成的蛋白质。SCR<,13b>在N端含有24个氨基酸的信号肽区域，在C端有由54个氨基酸组成的成熟蛋白区域。在原核细胞中表达并纯化了SCR<,13b>蛋白，获得了一个约32kDa左右的蛋白质条带，为进一步探讨SCR<,13b>的功能奠定了基础。 (3)确定了克服花粉白交不亲和性的CO<,2>激光和高压静电场的处理剂量，即CO<,2>激光的T<,1>S<,1>(烧灼延时5’，照射一次)处理，高压静电场的E3(75kV/m)处理。 (4)通过测量花粉管萌发率及一定时间内花粉管的萌发长度，我们知道在花粉萌发培养基中加入自交不亲和系同株柱头的蛋白粗提物会抑制花粉管的萌发和生长。萌发前加入不亲和柱头蛋白，电场处理的萌发率高于未处理花粉的萌发率；萌发后加入不亲和柱头蛋白，电场处理过的花粉管能继续生长，而未处理的花粉管则停止生长。 (5)用nuo-3标汜花粉管中的Ca<'2+>，激光共聚焦显微镜观察后发现电场处理过的花粉受到不亲和刺激后仍然保持着Ca<'2+>浓度梯度，花粉管可继续生长；而没有被电场处理过的花粉受到不亲和刺激后其Ca<'2+>浓度梯度消失，Ca<'2+>在花粉管内呈弥散状态。 (6)通过蛋白质双向电泳实验，我们比较了电场处理花粉自交授粉3h(电场)后柱头蛋白的表达、未处理花粉自交授粉3h(自交)后柱头蛋白表达、杂交授粉3h(杂交)后柱头蛋白表达、未授粉空柱头(CK)的蛋白表达四者之间的差异，结果显示电场处理后的蛋白表达与杂交的蛋白表达相似，都在同一区域比CK和白交图谱多了一些表达点，说明这些点是授粉后亲和情况下表达的蛋白点，而电场处理使本应不亲和的过程变得亲和，电场对克服植株的自交不亲和性起到了一定作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1羽衣甘蓝简介

1.1.1羽衣甘蓝

1.1.2羽衣甘蓝的实用价值

1.1.3羽衣甘蓝的育种难题

1.2自交不亲和

1.2.1自交不亲和的概念

1.2.2自交不亲和的分类

1.2.3自交不亲和的研究意义

1.2.4芸薹属孢子体自交不亲和性概述

1.3激光、高压静电场克服植物自交不亲和性的可行性研究

1.3.1激光的生物学效应及其发展现状

1.3.2高压静电场的生物学效应及其发展现状

1.4本研究的目的意义

2羽衣甘蓝SRK基因的克隆与表达

2.1羽衣甘蓝SRK激酶域cDNA片段的克隆

2.1.1材料与试剂

2.1.2试验方法

2.1.3结果与分析

2.2羽衣甘蓝SRK表达序列全长的克隆

2.2.1材料与试剂

2.2.2试验方法

2.2.3结果与分析

2.3 Northern杂交检测羽衣甘蓝SRK的表达情况

2.3.1材料与试剂

2.3.2试验方法

2.3.3结果与分析

2.4本章小结

3羽衣甘蓝SCR基因的克隆与表达

3.1羽衣甘蓝SCR cDNA片段的克隆

3.1.1材料与试剂

3.1.2试验方法

3.1.3结果与分析

3.2羽衣甘蓝SCR DNA片段的克隆

3.2.1材料与试剂

3.2.2试验方法

3.2.3结果与分析

3.3羽衣甘蓝SCR基因在大肠杆菌中的表达与纯化

3.3.1材料与试剂

3.3.2试验方法

3.3.3结果与分析

3.4本章小结

4激光、高压静电场处理对甘蓝自交不亲和性的生物效应

4.1花粉萌发培养基的选择

4.1.1材料与器材

4.1.2试验方法

4.1.3结果与分析

4.2 CO2激光和高压静电场的处理剂量的确定

4.2.1材料与器材

4.2.2试验方法

4.2.3结果与分析

4.3观察花粉管状态确定高压静电场处理对自交不亲和反应的影响

4.3.1材料与器材

4.3.2试验方法

4.3.3结果与分析

4.4高压静电场处理对自交不亲和花粉管钙离子梯度的影响

4.4.1材料与器材

4.4.2试验方法

4.4.3结果与分析

4.5高压静电场处理对自交不亲和花粉萌发中蛋白质表达的影响

4.5.1材料与试剂

4.5.2试验方法

4.5.3结果与分析

4.6本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢