木耳α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的克隆及表达分析

摘要

木耳（Auricularia auricula）是兼具食用价值与药用价值的食用菌之一，具有很大的研究价值。但是由于日前全面停止商业采伐，导致木耳生长所需的木屑原料出现短缺，更有可能导致木耳产业的停滞。我国是农业大国，每年有大量的农业秸秆产生，秸秆的成分主要是半纤维素，而木耳是木腐菌，降解纤维素的能力很强，对半纤维素的降解能力较弱，想要利用农业秸秆中的半纤维素就需要提高木耳降解半纤维素的能力，半纤维素的降解主要由β-1，4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶以及乙酰木聚糖酯酶的协同作用完成，其中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于半纤维素的侧链，在半纤维素降解过程中具有重要的作用。本研究对木耳体内的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因进行研究，以期得到α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的表达蛋白，提高α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在木耳体内的表达量，主要研究了以下几个内容。
　　(1)对实验室保存的木耳栽培菌株DL202提取其总RNA并进行RNA-Seq技术分析。基于木耳转录组数据，筛选出在半纤维素降解过程中具有重要作用的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，利用RACE技术克隆全长并进行生物信息学分析。最终筛选出的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因为Unigene3150，简称α-af基因，参与第21条代谢通路。成功获得了长为1953bp的完整开放阅读框，其编码的蛋白为71.19kD，等电点为5.23，有信号肽，无跨膜区，亚细胞定位为分泌蛋白。
　　(2)将得到的α-af基因全长序列构建载体后进行原核表达，并利用SDS-PAGE技术检测诱导表达结果。结果表明原核表达载体pET-32a-α-af构建成功，并且成功表达出与预测大小相符的蛋白。
　　(3)研究了采用5种不同的碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-木糖和L-阿拉伯糖培养木耳菌丝后对木耳体内的α-af基因相对表达量的影响。结果表明经麦芽糖和L-阿拉伯糖诱导后的木耳菌丝体内的α-af基因相对表达量较高，分别达到了对照的4.53和5.10倍。
　　综上所述，基于木耳DL202的转录组数据，克隆得到了α-af基因的全长并成功表达，研究得到对α-af基因诱导效果最好的碳源为L-阿拉伯糖。为提高木耳降解半纤维素的能力提供了理论基础，同时为采用农业秸秆代替木屑栽培木耳提供了科学依据。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题研究的目的和意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 半纤维素酶概述

1．2．2 木聚糖酶研究进展

1．2．3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶研究进展

1．2．4 转录组研究进展

1．2．5 RACE技术研究进展

1．2．6 实时荧光定量PCR的研究进展

1．3 论文的主要研究内容

2 木耳α-αf基因全长克隆及生物信息学分析

2．1 材料和方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 供试培养基

2．1．3 主要仪器和试剂

2．1．4 引物

2．1．5 木耳总RNA提取

2．1．6 RNA完整性和质量检验

2．1．7 基因筛选

2．1．8 反转录RT-PCR得到cDNA

2．1．9 α-αf基因片段的扩增

2．1．10 目的片段胶回收

2．1．11 目的片段的克隆测序

2．1．12 5’RACE cDNA和3’RACE cDNA第一链合成

2．1．13 5’RACE

2．1．14 3’RACE

2．1．15 木耳α-αf基因全长克隆

2．1．16 木耳α-αf生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 RNA提取结果

2．2．2 基因筛选结果

2．2．3 α-αf基因片段扩增结果分析

2．2．4 α-αf基因5’RACE结果分析

2．2．5 α-αf基因3’RACE结果分析

2．2．6 木耳α-αf基因全长克隆结果分析

2．2．7 木耳α-αf基因的生物信息学分析

2．2．8 木耳α-αf蛋白二级结构预测

2．2．9 木耳α-αf蛋白三级结构预测

2．2．10 木耳α-αf基因序列亲缘性分析

2．3 本章小结

3 木耳α-αf基因原核表达

3．1 材料和方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要仪器和试剂

3．1．3 引物

3．1．4 木耳α-αf基因扩增并转化大肠杆菌感受态DH5α

3．1．5 pMD18-T-α-αf质粒提取

3．1．6 质粒双酶切

3．1．7 重组载体pET-32a-α-αf构建

3．1．8 木耳α-αf基因的原核表达

3．2 结果与分析

3．2．1 pMD18-T-α-αf质粒双酶切检验

3．2．2 重组载体pET-32a-α-αf双酶切检验

3．2．3 重组载体的SDS-PAGE检测

3．3 本章小结

4 不同碳源对木耳α-αf基因相对表达量的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 供试培养基

4．1．3 仪器及试剂

4．1．4 引物

4．1．5 菌丝RNA提取

4．1．6 qRT-PCR模板cDNA制作

4．1．7 qRT-PCR

4．2 结果与分析

4．2．1 RNA质量检测

4．2．2 qRT-PCR结果

4．3 本章小结

结论

研究展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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