木聚糖酶与阿拉伯呋喃糖苷酶基因在毕赤酵母中共表达的研究

摘要

半纤维素是地球上一种储量丰富且价格低廉的可再生资源。但它却因为天然结构的复杂性而较难得以利用。木聚糖作为半纤维重要组成成分需要多种酶共同作用才能将其分解。木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶分别是降解木聚糖主链和侧链的两种酶。它们主要来源于木霉,曲霉等真菌以及瘤胃球菌,纤维杆菌等原核生物。通过培养这些原始菌株来获得可以分解木聚糖的酶系,但所需要的条件复杂,不符合工业需求,且酶产量低,不易纯化。因此限制了木聚糖酶系商业化的进程,也大大减慢了半纤维素利用的发展。
　　根据以上所述的不足,本研究选取里氏木霉中的木聚糖酶基因(xyn2)和阿拉伯呋喃糖苷酶基因(abf1),把它连接到经过抗性改造的pGAPGαA载体中,以目前最常用来表达外源蛋白的巴斯德毕赤酵母(X-33)为宿主,构建了能够共表达木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的重组毕赤酵母。实验表明:商业载体 pGAPZαA的抗性基因被成功替换成G418抗性基因并更名为pGAPGαA;木聚糖酶基因xyn2和阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf1被成功插入表达盒中串联到pGAPGαA上,获得重组载体pGAPGαA-xyn2-abf1;经过酵母电转化法,将重组载体整合至毕赤酵母基因组,构建成共表达重组毕赤酵母p-pGAPGαA-xyn2-abf1,并经菌落PCR验证整合成功。
　　在重组毕赤酵母摇瓶培养实验中,重组木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶酶活在培养72h时达到最高,分别为0.39 IU/mL和0.036 IU/mL;对这两种酶进行酶活特性分析时发现重组木聚糖酶XYN2最适温度为50℃,最适pH为5,重组阿拉伯呋喃糖苷酶ABF1为60℃,pH为4。
　　为了更好的进行高密度培养,进行了培养基优化实验。该实验通过摇瓶培养比较了葡萄糖,甘油,蔗糖,麸皮这四种单一碳源,以及葡萄糖甘油混合碳与单一碳源对重组毕赤酵母生长于酶活分泌的影响,最终确认葡萄糖与甘油1:1混合碳源更适合作为发酵的碳源并确定了碳源浓度为4％。然后比较了牛肉膏,蛋白胨,玉米浆及YP(酵母提取物和蛋白胨)这四种氮源对于重组毕赤酵母生长与酶活分泌的影响,最后确定了以3%玉米浆作为发酵培养基的氮源。在5L发酵罐的重组毕赤酵母高密度培养中:菌体最高OD600值为320,重组木聚糖酶最高酶活为0.65 IU/mL,比摇瓶培养时酶活增加了1.6倍;重组阿拉伯呋喃糖苷酶最高位0.33 IU/mL比摇瓶培养时提升了9倍。
　　最后进行了重组酶酶解自制半纤维素的实验。该实验对比了重组木聚糖酶单酶和重组木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶双酶酶解半纤维素情况的差异。实验结果说明双酶作用的产物和单酶作用的存在显著性差异,前者低聚木糖得率比后者高8%。相比单酶的处理,本共表达体系对于半纤维素有着更为有高效水解能力和产生低聚木糖的能力。
　　本论文构建重组了能够产生重组木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的毕赤酵母,初步探究了其生长特性和酶的理化性质及高密度培养时培养基的条件及培养参数优化。了解木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶对木聚糖的协同作用以及重组酵母共表达获得低聚木糖的情况。为今后重组毕赤酵母工业化产酶奠定了基础,也为低聚木糖的生产提供参考依据。

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2 木聚糖

1.3 木聚糖酶

1.4 阿拉伯呋喃糖苷酶

1.5 巴斯德毕赤酵母表达体

1.6 本研究的目的与意义

1.7 研究内容

第二章 巴斯德毕赤酵母表达载体的改造

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第三章xyn2与abf1双基因共表达载体的构建

3.1 引言

3.2 实验材料：

3.3 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 重组毕赤酵母的特性和酶活力研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 重组酶对于半纤维素的综合酶解研究

5.1实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

全文总结与展望

参考文献

在校期间发表论文

致谢