重组纳豆激酶基因在双子叶植物中的转化与表达

摘要

纳豆激酶是一种具有溶解血栓功能的蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶类。最初是从日本传统发酵食品纳豆(natto)中提取得到的。它由枯草芽孢杆菌产生，有较强的纤溶活性。具文献报道，纳豆激酶具有安全性好、半衰期长、口服有效等优点，受到了广泛的关注。
　　 本实验对来源于纳豆芽孢杆菌的纳豆激酶基因通过农杆菌介导在烟草与番茄两种表达系统中的表达进行了以下几个方面的研究工作：
　　 1.将编码纳豆激酶基因成熟肽的Nattokinase序列，克隆到植物表达载体pCIAMBIA2300上，构建了重组质粒pCIAMBIA2300-NK。其中Nattokinase基因的上游和下游分别具有植物中特异的启动子和终止子。
　　 2.活化根癌农杆菌EHA105，采用冻融法将pCIAMBIA2300-NK转化入EHA105，命名为EHA105-NK。
　　 3.通过农杆菌介导，叶盘法转化烟草叶片，诱导愈伤组织形成及分化成幼苗，进而再生出完整植株。提取再生植株基因组DNA，通过PCR扩增检测，结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到烟草植物基因组中。RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达。
　　 4.通过农杆菌介导，叶盘法转化番茄子叶和胚轴，诱导愈伤组织形成，及长出不定芽。提取再生植株基因组DNA，通过PCR扩增检测，结果表明纳豆激酶基因已成功整合到烟草植物基因组中。
　　 5.提取经检测为阳性的转基因烟草植株的叶片植物总蛋白，SDS-PAGE检测，结果表明转入了纳豆激酶基因的植株有大小与纳豆激酶蛋白大小一致的特征性的蛋白表达。纤维蛋白平板法检测有纤溶活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写

声明

第一部分 文献综述

1. 植物基因工程研究背景

1.1 植物基因工程的发展

1.2 植物基因工程的应用

1.3 双子叶植物研究现状

1.4 植物转基因技术

2 纳豆激酶研究背景

2.1 纳豆激酶的生化特性

2.2 纳豆激酶的生物学功能

2.3 纳豆激酶的溶栓机制

2.4 纳豆激酶溶栓活性的测定方法

2.5 纳豆激酶基因工程现状

3 本实验研究目的及意义

第二部分 材料与方法

1 材料

1.1 菌株和种子

1.2 质粒

1.3 酶与试剂

1.4 培养基

1.5 溶液

2 实验方法

2.1 纳豆芽孢杆菌总DNA的提取

2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3 质粒pUCm—T和pCAMBIA2300转化大肠杆菌

2.4 质粒DNA的小量制备

2.5 质粒DNA的纯化

2.6 DNA的限制性消化和连接

2.7 农杆菌感受态的制备及转化

2.8 农杆菌转化子的PCR检测

2.9 感染菌液的制备

2.10 种子的无菌萌发

2.11 外植体的转化与筛选

2.12 转化植株的鉴定

第三部分 结果与讨论

1. 纳豆激酶基因的分离与克隆

1.1 nk的引物设计

1.2 纳豆激酶基因的克隆

1.3 重组质粒T—nk的构建

2 植物双元表达载体pCIMBIA2300—nk的构建

3 农杆菌转化子的制备与鉴定

4 双子叶植物遗传转化

4.1 烟草

4.2 番茄

5 讨论与展望

5.1 讨论

5.2 展望

参考文献

致 谢