含有番茄LeEXP2基因的重组载体及重组菌及LeEXP2基因在重组菌中的表达

摘要

本发明公开了含有番茄LeEXP2基因的重组载体及重组菌及LeEXP2基因在重组菌中的表达，本发明首先从番茄中克隆了LeEXP2基因；进一步将LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体；通过电转化获得一种含有番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌；诱导番茄LeEXP2基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的表达；本发明的重组菌能有效地表达目的蛋白LeEXP2。克服了现有技术从植物中纯化出膨胀素的量有限，无法大量应用到纤维素降解中，自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，本发明获得的LeEXP2蛋白能提高纤维素酶降解纤维素的效率，对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种含有番茄LeEXP2基因的重组载体、含番茄 LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌及番茄LeEXP2基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导 表达。

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用其进行生 物转化生产燃料乙醇等化学品，对于当前人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题 具有极其重要的意义。纤维素特殊的晶体结构使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子内部的 糖苷键，酶解消耗大量的纤维素酶和时间已成为生物质转化的瓶颈^[1]。目前运用化学试剂或 高温高压等方式改变纤维结构不仅成本高和费时，而且也会带来环境污染。因此，寻找温 和、高效、环保的改变纤维结构的方法尤为迫切。

膨胀素(Expansins)是高等植物的细胞壁中普遍存在的一类蛋白质，能增强细胞壁的延 展能力，松弛植物细胞壁从而使细胞扩增，在植物的生长发育及应答胁迫中扮演重要角色^[2-3]。目前发现Expansins主要有四个基因家族，即α-expansin(EXPA)，β- expansin(EXPB)，expansin-like A (EXLA)和expansin-like B (EXLB)^[4]。Expansin的 典型结构特点为N-端信号肽，D1(Domain1)和D2(Domain2)两个结构域由Linker相连。 最近在线虫^[5]紫贻贝^[6]，少数真菌和细菌等生物中也发现了一些在结构上类似于植物 Expansin的同源蛋白^[7-10]。细胞壁是棉、麻和纸等纤维素产品的原材料，若能利用膨胀素改 善或降解纤维素，将会对清洁降解纤维素生产化工品有重要的意义。但从植物的总蛋白中 纯化出单一的Expansin蛋白不仅步骤繁琐难度大而且纯化的量也较为有限，而且植物膨胀 素难于在细菌的中大量表达^[11]。这限制了Expansin的应用。

番茄的Expansins家族有LeEXP1，LeEXP2，LeEXP3等蛋白，LeEXP2被报道在膨胀、成 熟的组织中表达，参与细胞伸长等方面的生理角色^[12-13]，但目前尚未将其在番茄体外的其他 宿主中表达，也未用其提高纤维素酶降解纤维素材料效率。

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发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种含有番茄LeEXP2基因的重组载 体。

本发明的第二个目的是提供一种含番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌。

本发明的第三个目的提供一种番茄LeEXP2基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表 达。

本发明的技术方案概述如下：

一种含有番茄LeEXP2基因的重组载体，用下述方法构建：

(1)提取番茄的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示 的744bp的LeEXP2基因，连接至TA载体pGEM-T，获得含有番茄LeEXP2基因的质粒 pGEM-LeEXP2；

(2)LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒pGEM-LeEXP2为模板，以序 列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得 序列表中SEQ ID NO.6所示的703bp片段，将所述703bp片段经TA克隆连至pGEM-T载 体，命名为pTLeEXP2；提取质粒pTLeEXP2和巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha A 质 粒，用EcoRI和XbaI同时酶切pTLeEXP2和pPICZalpha A，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切 pTLeEXP2得到SEQ ID NO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalpha A得到的SEQ ID NO.8 所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含 Zeocin 25μg/mL的LB平板，培养12-16h，得到含pPICZalpha A-LeEXP2质粒的大肠杆 菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha A-LeEXP2质粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重组载 体。

一种含有番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌，用下述方法获得：

将10-15μg的pPICZalpha A-LeEXP2质粒，用PmeI酶切成SEQ ID NO.9所示的 4219bp片段，乙醇沉淀SEQ ID NO.9所示的线性DNA片段，干燥所述线形DNA片段后溶于 无菌水，制成浓度为0.5-1μg/μL的线形DNA溶液；将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌X33 的感受态细胞与10μL的0.5-1μg/μL的线形DNA溶液混合匀后转移到0-4℃预冷的电极 杯中，冰浴5min，1500V电击5ms，电击后加入1mL冰冷的1M山梨醇水溶液到电转杯中， 混匀，将混合液转移到离心管中，28-30℃静置培养1-2h，在含100μg/mL Zeocin的YPD 平板上涂50μL-200μL培养后的混合液，30℃倒置培养至菌落出现，PCR鉴定菌落，PCR 结果为阳性的菌落为含有番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)， 将其中的重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)L15CGMCC NO.4123进行保藏，保藏 单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期：2010年8月27日，(见保藏存活证明)。

番茄LeEXP2基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达，包括下述步骤：

①将含有番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌和巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别接种在 2-3ml pH＝4.8的BMGY中预培养，200-250转/分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6；

②按1∶100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，200-250转 /分钟，28-30℃培养至OD₆₀₀＝2-6；

③将步骤②培养的菌液分别转接加入至50ml pH＝4.8的含体积浓度为0.5％-1％甲醇的BMMY 培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝0.8-1.5；在200-250转/分钟，28-30℃摇床中培养，每24h补 甲醇至0.5％-1％，诱导LeEXP2因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的表达。

本发明的重组菌能有效地表达目的蛋白LeEXP2。克服了现有技术从植物中纯化出膨胀 素的量有限，无法大量应用到纤维素降解中的不足，蛋白LeEXP2能协同纤维素酶提高纤维素 降解产生还原糖的效率。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，通过本发明的方法获得的 LeEXP2蛋白能提高纤维素酶降解纤维素的效率，避免了现有技术用高温高压和酸碱水解预 处理纤维素等方法对环境造成的污染，这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源，解决 当前能源危机具有极其重要的意义。

附图说明

图1为LeEXP2基因的PCR产物凝胶电泳。泳道1所示的DNA标准分子量Marker；泳道2 所示的为LeEXP2的PCR产物凝胶电泳结果。

图2为含有番茄LeEXP2基因的质粒pGEM-LeEXP2的构建策略图。

图3为pTLeEXP2质粒酶切凝胶电泳。图中泳道1为限制性内切酶EcoRI和XbaI双切 pTLeEXP2质粒；泳道2为pTLeEXP2质粒对照；M为DNA标准分子量Marker。

图4为pPICZalpha A质粒酶切凝胶电泳。图中M为DNA标准分子量Marker，泳道1为 pPICZalpha A的EcoR I和XbaI双切产物泳道2为pPICZalpha A质粒对照。

图5是将LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体时，转化后得到的重组质粒酶切鉴定 结果：图中泳道1是质粒对照；泳道2是限制性内切酶EcoRI单切质粒产生的4219bp片 段；泳道3是XbaI单切质粒产生的4219bp；泳道4是EcoRI和XbaI双切质粒产生的 3530bp和689bp两个DNA片段；泳道M为DNA标准分子量Marker。

图6为LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体的构建策略图。

图7为质粒LeEXP2-pPICZalpha A酶切凝胶电泳。图中泳道1为pPICZalpha A-LeEXP2质 粒对照；泳道2是质粒pPICZalpha A-LeEXP2的经PmeI单切产生的4219bp的DNA片段； 泳道M为Marker。

图8为PCR鉴定重组巴斯德毕赤酵母菌株。图中M为Marker；泳道1到9分别对应L7， L9，L10，L11，L12，L13，L14，L15，L16等菌株的PCR结果；泳道10是用X-33的DNA作 为PCR阳性对照扩增产生的2.2kb的片段，泳道11是用水为模板作为PCR阴性对照的结 果。

图9为不同诱导时间重组菌株L15分泌的总蛋白电泳图。泳道1为蛋白Marker，泳道2-9 为重组菌1-8天分泌表达的LeEXP2，泳道10为对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33在第 8天分泌的蛋白。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 番茄LeEXP2基因的克隆

用Trizol试剂按照试剂盒说明提取番茄的总RNA：取2ug总RNA，用反转录试剂盒将 其反转录成cDNA(Promega公司)，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示 的744bp的LeEXP2基因(见图1)。回收PCR产物，连接至TA载体pGEM-T(Promega公 司)得到新的质粒，经测序证实该质粒含有番茄LeEXP2基因，质粒命名为pGEM- LeEXP2，即获得含有番茄LeEXP2基因的质粒pGEM-LeEXP2。构建策略见图2。

实施例2 LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体

以质粒pGEM-LeEXP2为模板，以序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为上游引物， 以序列表中SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的703bp片段，将所述703bp片段与TA克隆载体pGEM-T连接转化大肠杆菌 TOP10F′得到的转化子，经鉴定转化子中的质粒是由LeEXP2基因与pGEM-T连接而成，将转 化子获得的新质粒命名为pTLeEXP2，并从上述转化子提取质粒pTLeEXP2，并从含有酵母表 达载体pPICZalpha A质粒的大肠杆菌中提取pPICZalpha A质粒，用EcoRI和XbaI同时酶 切质粒pTLeEXP2和pPICZalpha A；琼脂糖凝胶电泳酶切产物(图3和图4)，经琼脂糖凝 胶电泳后回收酶切pTLeEXP2质粒得到SEQ ID NO.7所示的689bp片段(图3)和酶切 pPICZalpha A质粒得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段(图4)。回收产物连接后转化 到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin(购自Invitrogen公司)25μg/mL的 LB平板，37℃倒置培养12-16h，菌落长至直径为1-2mm；挑选平板上的单克隆，通过菌裂 解PCR筛选阳性克隆，提取质粒后用EcoRI和XhaI酶切验证载体上外源基因的插入：单切 质粒皆产生片段4219bp，双切质粒皆产生3530bp和689bp片段(图5)，验证结果与预期 一致，经测序证实后，命名为pPICZalpha A-LeEXP2，即得到含pPICZalpha A-LeEXP2质粒 的大肠杆菌。提取大肠杆菌中pPICZalpha A-LeEXP2质粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的 重组载体。构建策略见图6。

实施例3 LeEXP2基因整合至巴斯德毕赤酵母染色体：

取10-15μg pPICZalpha A-LeEXP2质粒，用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.9所示的 4219bp片段，电泳检测如图7所示产生4219bp片段，经酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀线性 SEQ ID NO.9所示的线性DNA片段，干燥后溶于无菌水，制成DNA浓度为0.5-1μg/μL线 形DNA溶液；

参照精编分子生物学实验指南(第四版)(P512-513)中的电穿孔转化制备酵母感受态 细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌X-33的感受态细胞，将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33的感受态细胞与10μL的0.5-1μg/μL线形DNA溶液混匀后，转移到4℃预冷的电极 杯中，冰浴5min，电压1500V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后 立即加入1mL冰冷的1M山梨醇水溶液到电转杯中，混匀，将混合液转移到15mL离心管 中，28-30℃静置培养1h，在含100μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板 上涂100μL培养后的混合液，30℃倒置培养直至重组菌出现。

YPD培养基为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。

预冷的电极杯的温度也可以是0-4℃中的任意一值；28-30℃静置培养的时间也可以是 1-2h中的任意一值；在平板上涂培养后的混合液的体积也可以是50μL-200μL中的任意一 值。以上实验均可获得含有LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌。

实施例4 LeEXP2巴斯德毕赤酵母转化子的PCR鉴定

提取实施例3中所获得的重组菌的基因组DNA，以重组菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，以检测外源DNA的插 入，巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的染色体基因组DNA为模板的PCR作为阳性对照，以水为 模板的PCR作为阴性对照。PCR扩增条件为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸 3min。PCR产物电泳，如图8所示L7，L9，L10，L11，L12，L13，L14，L15，L16等菌株皆 能扩增出插入到巴斯德毕赤酵母宿主菌X33染色体上的包括LeEXP2基因的1.215kb的片 段，以及巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的AOX1基因的2.2kb基因片段，说明上述重组菌皆整 合有LeEXP2基因。

实施例5甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的LeEXP2基因表达

①接种经实施例4鉴定的含有LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌L7，L9，L10， L11，L12，L13，L14，L15，L16和巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别转接至2ml，pH＝4.8的 BMGY培养基预培养，220转/分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

②按1∶100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25ml BMGY培养基中，220转 /分钟，29℃培养至OD₆₀₀＝4；

③将步骤②培养的菌液分别转接加入至50ml pH＝4.8的含体积浓度为0.5％甲醇的 BMMY培养基中，使菌液的浓度OD₆₀₀＝1，在220转/分钟，29℃摇床中培养，每24h补甲醇至 0.5％，诱导重组菌分泌表达LeEXP2。为检测LeEXP2能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组 巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行蛋白电 泳。取样及电泳方式如下：取100μl培养基，离心后，取上清16μl与4μl的上样缓冲 液混合，沸水煮5分钟后，取12ul电泳。如图9所示，随着诱导时间的增加，目的蛋白 LeEXP2分泌的越多，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白LeEXP2的分泌 (图9为不同诱导时间重组菌株L15分泌的总蛋白电泳图)，各个菌株分泌表达的LeEXP2 也有所差异，其中重组菌L15分泌的重组蛋白LeEXP2的量较大，因此，将重组巴斯德毕赤 酵母菌(Pichia pastoris)L15 CGMCC NO.4123进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期： 2010年8月27日，(见保藏存活证明)。

步骤①和②中培养的转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是 28℃-30℃中的任意一值；培养菌的浓度OD₆₀₀也可以是2-6中的任意一值。步骤③中BMMY培养 基中含甲醇的浓度也可以是0.5％-1％中的任意一值；菌体的浓度OD₆₀₀也可以是0.8-1.5范围中 任意一值；转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是28℃-30℃中的 任意一值，每24h补甲醇的浓度也可以是0.5％-1％中的任意一值。通过电泳证明这些条件下 也可以完成诱导巴斯德毕赤酵母转化子的LeEXP2基因表达。

BMGY培养基为1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮基，100mM磷酸钾，4x10^-5％生物素，1％甘油，余量为水。

BMMY培养基为1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮基，100mM磷酸钾，4x 10^-5％生物素，0.5％-1％甲醇，余量为水。

上样缓冲液为15.1g/L的Tris，94g/L甘氨酸；5.0g/L十二烷基硫酸钠 (SDS)，余量为水。

实施例6 LeEXP2提高纤维素酶降解滤纸的效率

用实施例5的方法诱导巴斯德毕赤酵母宿主菌X33和重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia  pastoris)L15 CGMCC NO.4123(简称重组菌L15)，当诱导第六天时，分别取巴斯德毕赤酵 母宿主菌X33和重组菌L15分泌表达的培养基2毫升，12000转/分钟离心1分钟后，取 1.5ml上清与50mg的新华滤纸条在25ml具塞试管中室温下温浴48h，再加入0.5ml的7U/L 纤维素酶(Sigma Aldrich公司)液进行反应，50℃水浴1hr后，每管加入3mlDNS溶液， 沸水浴加热5min，冷却至室温后定容至25ml，测定OD₅₄₀的值，依据葡萄糖的标准曲线来确 定释放的葡萄糖的量(葡萄糖标准曲线的测定方法如下：分别将2毫升浓度为0，0.5，1， 1.5，2.0，2.5，3.0.3.5，4.0mg/ml的葡萄糖溶液与3毫升DNS混匀，沸水浴加热5min，冷却 至室温后定容至25ml，测定OD₅₄₀的值，以浓度为横坐标，以各OD₅₄₀的值为纵坐标绘制标准 曲线)。重组菌L15的培养基中含有LeEXP2蛋白，其与纤维素酶作用滤纸产生的还原糖是 1.34mg；而对照巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的培养基中未有LeEXP2分泌，与纤维素酶作用滤 纸产生的还原糖是0.88mg。重组菌L15诱导表达的LeEXP2与纤维素酶协同作用滤纸产糖 是纤维素酶单独作用的1.52倍。所述的DNS试剂成份如下：在1升DNS溶液中含10g的 3，5-二硝基水杨酸，10g NaOH，200g的酒石酸钾钠，2g的苯酚，5g的NaHSO₃，余量为 水。

将重组菌L7，L9，L10，L11，L12，L13，L14或L16采用本实施例的方法进行上述实 验，并证明LeEXP2协同纤维素酶降解滤纸纤维素比纤维素酶单独作用强。该试验说明了 LeEXP2能提高纤维素酶降解纤维素材料-滤纸的效率。