N+注入钝齿棒杆菌AS1.998原生质体选育L-Ile高产菌株

摘要

本论文以L-异亮氨酸生产菌钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998为出发菌株,运用N~+注入诱变钝齿棒杆菌AS1.998的原生质体,选育出了L-异亮氨酸高产菌株。最后运用单因素和正交设计试验对摇瓶培养条件下的最适种子培养基、发酵培养基组成及发酵条件进行研究,主要内容和结果如下:1.确立钝齿棒杆菌AS1.998原生质体最佳形成条件:对影响原生质体形成的再生的条件如青霉素浓度及处理时间,溶菌酶浓度、作用温度及作用时间,酶解时的转速等条件进行研究,确立了钝齿棒杆菌AS1.998的原生质体形成和再生的最适条件,使原生质体形成率可达98.53％以上,在再生完全培养基上培养,再生率可达25.6％~42.2％。2.探索选育诱变菌株的初筛方法—生长圈法的条件:考察了指示菌培养方法、加入的最适量、指示菌培养方法、加入时最适的培养基温度等条件,提高了生长圈法的精确度和灵敏度。3.改良测定发酵液中L-异亮氨酸的方法—纸层析-分光光度法:对显色剂直接加入到展层剂中进行了研究,实验表明,改良后的纸层析法不仅简化了操作步骤,节约了试剂,而且在测定L-异亮氨酸含量方面具有较高的准确度和精密度,适合应用于筛选高产L-异亮氨酸诱变菌株。4.以钝齿棒杆菌AS1.998为出发菌株,经N~+注入诱变其原生质体,筛选获得了L-异亮氨酸高产菌DN-21,在未经优化的发酵条件下产酸7.14g/L,比原菌株提高了43.66％,且菌株遗传稳定性良好。5.运用单因素法及正交试验设计对筛选到的高产菌株DN-21摇瓶发酵的种子培养基、发酵培养基进行了优化,采用优化后的培养基进行发酵实验,DN-21最高可产L-异亮氨酸8.93g/L。

目录

摘要

ABSTRACT

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引言

一 文献综述

1 离子注入技术及在微生物育种领域的应用

1.1 离子注入技术概述

1.2 离子注入技术的作用机理

1.3 离子注入技术在微生物领域的应用实例

2 原生质体诱变技术在微生物育种中的应用

2.1 原生质体诱变技术概述

2.2 原生质体诱变在工业微生物菌种选育中的应用

2.3 原生质体诱变在工业微生物育种中的应用前景

3 L-异亮氨酸的应用、测定及生产

3.1 L-异亮氨酸概述

3.2 L-异亮氨酸的结构及理化性质

3.3 L-异亮氨酸的应用

3.4 L-异亮氨酸的测定方法

3.5 L-异亮氨酸的生产方法及生产概况

4 立题依据及主要研究内容

二 材料与方法

1 实验材料

1.1 菌种

1.2 培养基

1.3 实验仪器及设备

1.4 部分试剂

1.5 部分溶液和试剂的配方

2 实验方法

2.1 L-异亮氨酸生产菌AS1.998原生质体形成与再生条件的研究

2.2 初筛方法—生长圈法的探索

2.3 发酵液中L-异亮氨酸的测定方法的改良

2.4 N~+注入原生质体选育L-Ile高产菌株

2.5 诱变菌株发酵条件的研究

三 实验结果

1.L-异亮氨酸生产菌AS1.998原生质体形成和再生条件的研究

1.1 钝齿棒杆菌AS1.998生长曲线的测定

1.2 青霉素钠盐预处理对原生质体形成和再生的影响

1.3 蛋清溶菌酶对原生质体形成和再生的影响

1.4 转速对原生质体形成和再生的影响

2 初筛方法—生长圈法的探索

2.1 指示菌的验证

2.2 钝齿棒杆菌AS1.1001生长曲线的测定

2.3 钝齿棒杆菌AS1.1001培养方法的确定

2.4 待测菌培养方法的选择

2.5 钝齿棒杆菌AS1.1001浓度的确定

2.6 钝齿棒杆菌AS1.1001加入检测平板时温度的确定

3 改良纸层析-分光光度法测定发酵液中L-异亮氨酸

3.1 展层剂中有机溶剂与水比例的确定

3.2 展层剂中茚三酮含量的确定

3.3 改良后纸层析-分光光度法测定L-Ile吸收波长的确定

3.4 改良后纸层析-分光光度法测定L-Ile最佳洗脱时间的确定

3.5 改良后纸层析-分光光度法的L-Ile标准曲线的绘制

3.6 实验方法改良后的重复性检验

3.7 实验方法改良后的回收试验

4 N~+注入原生质体选育L-异亮氨酸高产菌株

4.1 N~+注入诱变原生质体的结果

4.2 生长圈法初筛

4.3 复筛—改良的纸层析-分光度法

4.4 突变菌株遗传稳定性试验

5 诱变菌株发酵条件的研究

5.1 种子培养基的优化

5.2 发酵培养基的优化

5.3 摇瓶发酵条件的研究

5.4 发酵培养基正交试验

四 全文总结

1 结论

2 展望

参考文献

已发表文章

致谢