代谢工程构建钝齿棒杆菌精氨酸高产菌株

摘要

氨基酸生产工艺发展经历了热酸水解、化学合成及酶催化和微生物发酵的过程。随着人口的增加，以及各种氨基酸功能的进一步发展，其市场需求量以每年5-7%的比例稳健增加。L-精氨酸作为人体的半必需氨基酸，在人体中参与了尿素循环、氮元素的代谢并协助氨排出；也参与体内NO合成，间接影响生命体免疫、神经和心血管系统；同时还是作为精蛋白的重要组分之一，能影响人体生殖。因此被广泛用作食品、药品等的添加剂。目前，我国市场上的精氨酸还主要源于外国进口，或国内以猪毛发、动物皮毛作为原材料，经角蛋白酸水解而来。但无论是从经济节约或是环保视角出发，通过国内工程改造的研究，提高精氨酸的产量是最合适的方式。　　钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）是国内研究者从土壤中分离得到的革兰氏阳性菌，由于其基因组与谷氨酸棒杆菌相似度极高，具有谷氨酸棒杆菌相同的优点，已广泛用于氨基酸的生产，包括精氨酸。本文利用本实验室构建的菌株C. crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221和C. crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035为出发株，利用同源重组技术，通过对转录调控因子、副产物支流、NADPH还原力以及精氨酸代谢路径碳流等几方面加以干预，以获得精氨酸高产菌株。　　首先，在C. crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221菌中以大肠杆菌的lacI启动子替换转录调控因子farR原有的启动子，弱化脂肪酸相应蛋白FarR表达，荧光定量PCR鉴定结果显示，参与精氨酸合成基因gdh和argB表达量下调，参与NADPH合成基因zwf和gnd表达量下调，而与ODHC活性正相关基因odhA上调，负相关基因odhI表达量则下调；摇瓶发酵结果显示，细胞生长和葡萄糖消耗几乎无差异，但精氨酸产量下降约15%。说明FarR并不是精氨酸合成网络的负调控蛋白。　　其次，在C. crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035中将腐氨合成关键基因speE通过同源重组技术敲除，切除鸟氨酸分解代谢的副产物支路，精氨酸产量随发酵时间延长上升，120小时时上升到25%之多。　　最后，在C. crenatum MT argB M4△TSCP△pta△proB△cg12310△Ncgl1221△cobB::cg3035中异源表达丙酮丁醇梭菌gapC，其表达蛋白能催化产生NADPH和3-磷酸甘油醛，增加胞内NADPH积累。摇瓶发酵结果显示，精氨酸产量提升了15%；另外，本文基于NADH依赖性酶的挖掘，在菌株△proB位置上，异源表达枯草芽孢杆菌NADH-依赖性的谷氨酸脱氢酶基因rocG，与对照相比，精氨酸产量提高了21.5%。　　总之，本文通过敲除speE以及异源表达rocG和gapC，分别从阻断支流、增加碳流和增加NADPH积累及弱化farR表达等方面探索钝齿棒杆菌精氨酸高产菌株构建方法。

目录

声明

第1章 绪论

1.1氨基酸生产工艺历程

1.2.1传统方法

1.2.2代谢工程改造方法

1.3.1精氨酸的性质

1.3.2微生物精氨酸的合成

1.3.3哺乳动物精氨酸代谢

1.4精氨酸生产菌株介绍

第2章 farR弱化对钝齿棒杆菌精氨酸生产的影响

2.1前言

2.2.1实验菌株

2.2.2 质粒

2.2.3 试剂配制

2.2.4培养基配制

2.3实验方法

2.3.1引物设计与合成

2.3.2 DNA回收及纯化

2.3.3弱化T载体构建

2.3.4质粒提取

2.3.5大肠杆菌感受态制备

2.3.6大肠杆菌质粒转化

2.3.7lacI启动子替换载体构建

2.3.8电转感受态的制备

2.3.9电转过程

2.3.10单双交换子验证

2.3.11精氨酸摇瓶发酵实验

2.3.12精氨酸产量测定

2.3.13菌体生长情况测定

2.3.14培养基葡萄糖消耗情况测定

2.3.15数据分析

2.4结果与讨论

2.4.1 farR弱化上下臂及lacI启动子片段扩增

2.4.2弱化融合片段TA克隆验证结果

2.4.3弱化融合片段pk18mobsacB转化验证结果

2.4.4 farR弱化单双交换验证

2.4.5弱化菌株发酵结果

2.5小结

第3章 farR弱化对相关基因转录水平的影响

3.1前言

3.2.1菌株与质粒

3.2.2试剂与仪器

3.3.1引物设计

3.3.2 样品制备

3.3.3总RNA提取

3.3.4总RNA反转录

3.3.5 RT-qPCR反应体系

3.3.6数据统计

3.4.1总RNA提取结果

3.4.2基因组消除及反转录验证结果

3.4.3 RT-PCR数据处理结果

3.5讨论

第4章 支路基因speE的敲除对L-精氨酸产量的影响

4.1前言

4.2.1菌株和质粒

4.2.2主要仪器

4.2.3主要试剂

4.3实验方法

4.3.1引物设计及合成

4.3.2基因组提取

4.3.3大肠杆菌感受态制备

4.3.4质粒转化

4.3.5钝齿棒杆菌电转感受态制备

4.3.6感受态电转

4.3.7质粒提取

4.3.8 DNA回收纯化方法

4.3.9 pMD18-T及重组pK18mobsacB质粒的构建

4.3.10单双交换子的筛选和验证

4.3.11发酵实验

4.3.12发酵数据测定及处理

4.4实验结果及分析

4.4.1 PCR扩增及敲除臂融合电泳验证

4.4.2重组pK18质粒构建验证

4.4.3单交换子验证结果

4.4.4 speE敲除双交换验证

4.4.5 speE敲除菌发酵结果与分析

第5章 NADPH利用对精氨酸产量的利用

5.1前言

5.2实验材料

5.2.1菌株和质粒

5.2.2实验仪器及材料来源

5.2.3培养基及试剂

5.3实验方法

5.3.1引物设计及合成

5.3.2表达融合片段及表达质粒的构建

5.3.3感受态制备

5.3.4大肠杆菌转化

5.3.5电转感受态制备及电转

5.3.6单双交换子的验证

5.3.7摇瓶发酵实验

5.3.8发酵数据测定

5.4实验结果及分析

5.4.1片段up、down、gapC的扩增及融合结果

5.4.2重组质粒构建验证结果

5.4.3单交换验证结果

5.4.4双交换验证结果

5.4.5发酵数据处理结果与分析

第6章 结论与展望

6.1结论

6.1.1初步探索farR弱化对精氨酸产量影响的机理

6.1.2△speE对精氨酸生产的影响

6.1.3 rocG和gapC的异源表达对钝齿棒杆菌精氨酸产量的影响

6.2展望

参考文献

附录

附录A1 实验仪器

附录A2 试剂

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况