L-酪氨酸微生物转化及代谢产物分析鉴定

摘要

L-酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)属芳香族氨基酸，在生物体内代谢产物丰富多样，其中许多具有重要生理功能和药理特性，而且在发酵食品中其产物种类和含量会对食品的安全和生理效应产生重要影响，因此深入研究微生物对L-酪氨酸的转化产物很有必要。同时，通过微生物转化的研究可以开发L-酪氨酸代谢产物更为清洁高效的生物酶生产方法，对于推动其重要代谢产物在食品、医药、饲料、化工、疾病检测等领域的广泛应用具有重要研究价值和实践意义。
　　本研究从自然界富集得到106株菌株，通过初筛、复筛和重复对比实验，筛选得到菌株ZL-20，在不同条件下可转化得到8个产物。16SrDNA分子鉴定和系统发育进化树显示与Bacillusmegaterium同源率高达99.0％，结合其生理生化试验综合分析后鉴定为巨大芽孢杆菌。通过对其产酶培养基和转化条件等的优化，得到了其中3个主要产物各自单一产生的条件，并使转化率和转化浓度得到较大幅度提高。其中，产物①优化后24h转化率达到65％以上，较优化前提高21％左右;产物②36h转化率达到75％以上，较优化前提高33％左右;产物③48h转化率高达98％，较优化前提高25％左右。
　　在此基础上，通过转化液预处理、有机溶剂萃取、离子交换树脂分离、Prep-HPLC制备等对目标产物进行分离提取，并运用等电点冷却结晶、浓缩结晶以及重结晶等方法进一步纯化，经HPCE和HPLC纯度检测，产物①晶体纯度达98％以上，产物②达96％以上，产物③达95％以上。最后采用NMR和MS技术分别对三个转化产物进行结构鉴定，并结合ZL-20菌株16SrDNA分子鉴定结果和KEGGPathwayDatabase中L-酪氨酸代谢通路进行综合分析。结果表明:产物①为L-多巴，化学式为C9H11NO4，属于黑色素途径，L-酪氨酸经多酚氧化酶等羟基化而生成;产物②为4-羟基-烯醇-苯酮酸，化学式C9H8O4，属于氧化分解途径，首先经天冬氨酸转氨酶等作用生成对羟苯基丙酮酸，再经苯丙氨酸互变异构酶催化生成;产物③为对羟基苯乙胺，化学式C8H11NO，也属于氧化分解途径的一个分支，是L-酪氨酸在酪氨酸脱羧酶等作用下氧化脱羧生成。其中，苯丙氨酸互变异构酶在NCBI的Gene数据库中已知的菌属类型并没有芽孢杆菌。因此推测，该酶可能是在芽孢杆菌中未被发现的一种新酶。
　　综上，本研究筛得的菌株ZL-20稳定性好，转化产物丰富;经条件优化和分离提取，对其中三个产物顺利完成了分析鉴定，建立起了一套L-酪氨酸代谢产物分析研究的有效方法。为后续更多新产物的发现、具有工业应用潜力酶资源的开发及发酵类食品安全性评估等的进一步研究奠定了坚实的基础。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 L-酪氨酸及其衍生物的研究进展

1．1．1 L-酪氨酸的结构和性质

1．1．2 L-酪氨酸体内代谢和生理功能

1．1．4 L-酪氨酸代谢产物及其研究现状

1．2 微生物转化法概述

1．2．1 微生物转化及其主要方法

1．2．2 微生物转化的特点及优势

1．2．3 微生物转化的反应类型

1．2．4 微生物转化的应用领域

1．3 微生物代谢产物的分离纯化方法概述

1．3．1 发酵液的预处理

1．3．2 代谢产物的分离提取方法

1．3．3 代谢产物的晶体制备方法

1．4 氨基酸及其衍生物的分析鉴定方法概述

1．4．1 氨基酸和氨基酸衍生物的分析检测方法

1．4．2 氨基酸及氨基酸衍生物的结构鉴定方法

1．5 本课题研究的目的及意义

1．5．1 研究目的

1．5．2 研究意义

1．6 本课题研究的主要内容

2 L-酪氨酸转化菌株的筛选及16S rDNA分子鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 样品来源

2．2．2 主要仪器设备

2．2．3 主要试剂及配制

2．2．4 培养基及转化底物

2．2．5 转化及检测方法的建立

2．2．6 L-酪氨酸转化菌株的筛选方法

2．2．7 ZL-20菌株的形态观察分析

2．2．8 ZL-20菌株的16S rDNA分子鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 L-酪氨酸转化菌株筛选结果

2．3．2 ZL-20菌株的形态观察分析结果

2．3．3 ZL-20菌株的16S rDNA分子鉴定结果

2．4 本章小结

3 ZL-20菌株培养条件及转化体系的初步优化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 出发菌株

3．2．2 主要仪器设备

3．2．3 试剂及配制

3．2．4 培养基及转化底物

3．2．5 ZL-20菌株的生长曲线的测定

3．2．6 ZL-20菌株三个产物转化条件的初步确定

3．2．7 ZL-20菌株培养及转化条件单因素试验

3．2．8 ZL-20菌株转化底物正交试验优化

3．2．9 ZL-20菌株产酶培养基正交试验优化

3．3 结果与分析

3．3．1 ZL-20菌株的生长曲线测定结果

3．3．2 ZL-20菌株三个产物转化条件的初步确定结果

3．3．3 ZL-20菌株培养及转化条件单因素试验结果

3．3．4 ZL-20菌株转化底物正交优化试验结果

3．3．5 ZL-20菌株产酶培养基正交试验优化结果

3．4 本章小结

4 ZL-20菌株主要转化产物的分离提取及晶体制备

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 仪器设备

4．2．2 试剂及配制

4．2．3 转化液的预处理

4．2．4 产物①等电点冷却法初结晶

4．2．5 产物②离子交换树脂分离纯化

4．2．6 产物②和产物③有机溶剂萃取

4．2．7 三个转化产物的初结晶及重结晶

4．2．8 产物③重结晶Prep-HPLC的分离纯化

4．3 结果与分析

4．3．1 转化产物预处理结果

4．3．2 产物①等电点冷却法初结晶结果

4．3．3 产物②离子交换树脂分离纯化结果

4．3．4 产物②和产物③有机溶剂萃取结果

4．3．5 三个转化产物的结晶及重结晶结果

4．3．6 产物③Prep-HPLC分离纯化结果

4．4 本章小结

5 ZL-20菌株主要转化产物的结构鉴定及代谢分析

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 仪器设备

5．2．2 试剂及配置

5．2．3 产物①的NMR和MS结构鉴定

5．2．4 产物②的NMR和MS结构鉴定

5．2．5 产物③的NMR和MS结构鉴定

5．2．6 转化产物的代谢通路及作用酶分析

5．3 结果与分析

5．3．1 产物①的NMR和MS结构鉴定结果

5．3．2 产物②的NMR和MS结构鉴定结果

5．3．3 产物③的NMR和MS结构鉴定结果

5．3．4 转化产物的代谢通路及作用酶分析结果

5．4 本章小结

6 结论与讨论

6．1 结论

6．2 讨论

参考文献

个人简历和研究成果

致谢