旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子TsSPI的克隆表达与功能鉴定

摘要

旋毛虫病是一种人兽共患寄生虫病，是由于宿主食入了含有活的囊包幼虫引起的。当活的囊包幼虫进入宿主之后，在宿主的胆汁和胃液的刺激下，激活成为肠道期感染幼虫，在感染30~48h之内，虫体经过4次蜕皮，发育长成为成虫，成虫的雌雄虫交配后，雄虫一般立即死亡并随宿主的粪便被排出体外，雌虫则继续发育，感染5 d开始产出新生蚴，新生蚴随着宿主的淋巴管和血管循环至全身各个地方，但只有到达横纹肌的新生蚴能够继续发育成长为肌幼虫[1]。旋毛虫对宿主小肠上皮细胞的附着和侵入是其感染宿主的关键，但是其侵入机制目前尚不清楚。我们前期在旋毛虫成虫的分泌蛋白中鉴定出了旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子（Trichinella spiralisserine protease inhibitor，TsSPI），推测该蛋白可能参与旋毛虫的入侵。丝氨酸蛋白酶抑制因子能抑制丝氨酸蛋白酶的活性，是一组结构保守的蛋白超家族。该家族成员参与脊椎动物凝血级联、补体活化、炎症、细胞凋亡、细胞发育和纤维蛋白溶解等关键生物过程[2]。本实验对旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子（TsSPI，ID：Tsp_01570；蛋白ID：XP_003377380.1）采用分子克隆表达，纯化出了重组TsSPI（rTsSPI）并对TsSPI进行了qPCR分析、免疫荧光抗体定位分析；对rTsSPI的抑制功能进行分析；用抗rTsSPI血清进行了体外入侵和ADCC实验。旨在揭示TsSPI在旋毛虫侵入过程中的潜在功能。 材料与方法 1 旋毛虫、实验小鼠、质粒、菌株及细胞 旋毛虫为河南猪源地理株（ISS534）；实验小鼠有BABL/c和昆明小鼠；表达质粒为pQE-80L；表达菌株为BL21；细胞为本实验室分离得到的IECs。 2 TsSPI的生物信息学分析 在ExPasy网站对TsSPI（GenBank accession no. XP_003377380.1）进行理化性质预测和疏水性分析；在TMHMM网站预测跨膜结构；在SignalP4.1 Server进行信号肽预测；在TargetP 1.1 Server进行亚细胞定位分析。SWISS-MODEL网页版预测TsSPI的二级结构；PyMOL软件预测三级结构。用BioEdit Sequence Alignment Editor软件，将旋毛虫TsSPI与其他寄生虫、小鼠和人等 22个物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子的序列进行比对；用MEGA的临接法对这22个物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子进行1000次比对并绘制构建系统发育进化树。 3 TsSPI的克隆表达和酶活性抑制功能分析 用大肠杆菌表达 rTsSPI 并用镍柱对其进行亲和纯化；应用 SDS-PAGE 与 Western blot分析rTsSPI的抗原性。用BAEE在A253nm处的吸光度变化来计算其对胰酶的抑制率。 4 TsSPI的表达、免疫定位及其旋毛虫侵入过程中的功能检测 Real-time PCR分析TsSPI基因在不同期虫体的转录；IFA检测TsSPI在不同发育期虫体的表达与定位情况，通过Far-Western blot与IFA、荧光共聚焦显微镜检疫分析rTsSPI与正常小鼠肠上皮组织的结合情况，通过体外侵入实验观察抗rTsSPI小鼠血清对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞（IECs）的影响，采用ADCC实验评价抗rTsSPI小鼠血清对NBL的杀伤性。 5. rTsSPI免疫小鼠诱导的免疫应答及保护效果 将60只雌性BALB/c小鼠分成3组（免疫组、佐剂组及PBS组），每只小鼠应用rTsSPI进行皮下注射免疫（20μg/只，免疫4次，间隔2周），采集免疫前及每次免疫后小鼠血清，采用ELISA法检测小鼠血清抗体IgG、IgG1、IgG2a的水平。末次免疫后7 d，每只小鼠经口感染 300条旋毛虫ML，感染后6d，每组剖杀10只，从收集肠道成虫，计算成虫减虫率。感染后35d每组剖杀另外10只小鼠收集肌幼虫，计算肌幼虫减虫率，评价rTsSPI对小鼠的免疫保护效果。 6 统计学处理 使用PASW Statistics 18软件对数据进行分析，数据采用均数±标准差，2组比较采用t检验，其他采用单因素方差分析，检验水准为α<0.05。 结果 1 旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子TsSPI的生物信息学分析以及其克隆表达与鉴定 用NCBI、ExPasy等在线网站分析预测了旋毛虫TsSPI的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域。结果显示，该基因序列全长1050 bP，编码349个氨基酸残基，蛋白质分子质量为39.59 kDa，等电点为5.78；TsSPI属于丝氨酸蛋白酶抑制因子家族。通过巢式PCR扩增出大小为1122 bp的TsSPI基因，将TsSPI基因一步克隆连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒pQE-80L/TsSPI，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析，发现在42.5 kDa处出现一条明显条带，在上清与沉淀中均有该蛋白的表达，证明表达的rTsSPI为可溶性蛋白。Western blot分析显示，rTsSPI蛋白能被小鼠感染旋毛虫血清识别，但不能被正常小鼠血清识别，说明该重组蛋白具有良好的抗原性。抗rTsSPI血清能识别旋毛虫不同发育期虫体蛋白和ES蛋白中天然的TsSPI，表明TsSPI在旋毛虫各个虫期均有表达。 2 TsSPI在不同期虫体的转录与表达 Real-time PCR分析表明TsSPI在3d成虫期的转录水平为肌幼虫期的1.79倍（F=15.380，P<0.05），新生幼虫期的转录水平为肌幼虫期的2.27倍（F=51.129，P<0.05），肠道感染幼虫期的转录水平为肌幼虫期的-7.77倍（F=76.004，P<0.01）。IFA结果表明，TsSPI在各个虫期（肌幼虫、肠道感染性幼虫、3d 与6d成虫及新生幼虫）都有表达，主要定位在虫体的表皮、杆状体及生殖器官等。 3 rTsSPI抑制trypsin的酶活功能 对rTsSPI进行生化实验分析，结果显示rTsSPI能够有效的抑制猪胰蛋白酶的活性，抑制率为59.33%。该重组蛋白在 25℃~90℃之间对 trypsin 活性均有一定的抑制性，且在温度为25℃时抑制率最高。 4 Far-Western和IFA检测rTsSPI与IECs的结合情况 Far-Western结果显示rTsSPI能够与小鼠的IEC蛋白的29条带结合，证明rTsSPI能够与IECs相互作用，但是具体作用机制及作用过程仍不清楚。而用抗rTsSPI小鼠血清来进行IFA检测，发现rTsSPI能够与正常小鼠小肠上皮细胞结合而与正常小鼠的肝组织没有结合，说明rTsSPI与小鼠肠上皮细胞的结合是特异性的，进一步说明了rTsSPI能够与小鼠小肠肠上皮细胞相互作用。 5 重组蛋白（rTsSPI）及其抗血清对旋毛虫体外入侵的影响 将血清加入含IECs的半固体培养基和旋毛虫幼虫共培养，结果显示抗rTsSPI血清组、感染旋毛虫小鼠血清组以及正常小鼠血清组幼虫侵入率分别为 38.7%、16.85%和80.08%，统计学分析结果显示抗rTsSPI血清组、感染旋毛虫小鼠血清组和正常小鼠血清组之间侵入率的差异有统计学意义（χ2=134.354，P<0.01）。抗rTsSPI血清对幼虫侵入IECs的抑制作用明显高于正常血清（χ2=119.551，P<0.01），且这种抑制作用是抗体剂量依赖性的(F=160.236，P<0.01)，表明血清rTsSPI血清可明显抑制旋毛虫对小鼠肠上皮细胞的侵入。 6 抗rTsSPI血清介导的ADCC 在含小鼠腹腔巨噬细胞的培养板中，分别加入不同血清和新生幼虫，观察 ADCC对旋毛虫新生幼虫的杀伤作用。感染旋毛虫小鼠血清组、rTsSPI免疫血清组、正常血清组和PBS组的死亡率分别为87.67%、27.67%、10.33%和6.33%（F=400.798，P<0.01）。rTsSPI 免疫血清组的幼虫死亡率明显高于正常血清组的幼虫死亡率（χ2=10.526，P<0.05）。细胞毒性与培养时间呈显着正相关（r= 0.968，P<0.01），随培养时间的延长幼虫死亡率呈现增加趋势（F= 117.584，P<0.01），并且细胞毒性为抗rTsSPI抗体剂量依赖性（r=-0.984，P<0.01），幼虫死亡率随着血清稀释度的增加呈下降趋势（F=96.813，P<0.01）。 7 rTsSPI免疫小鼠的保护作用 rTsSPI免疫小鼠攻虫感染后6d和35d，与PBS组相比，成虫和肌幼虫的减虫率分别为62.2%和57.25%(Fadult= 62.34，Flarva= 27.2，P<0.01)；并且佐剂组的成虫（22.27%与肌幼虫（2.04%）减虫率均明显低于免疫组(Fadult= 35.77，P<0.01；Flarvae=28.70，P<0.01)。 结论 1. 本实验成功克隆表达了旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制因子TsSPI，并且该蛋白具有良好的抗原性。 2. TsSPI存在于旋毛虫的各个生长阶段，主要定位在虫体表皮、杆状体及胚胎。 3. rTsSPI能够有效的抑制胰酶活性并与肠上皮细胞产生特异性结合；抗rTsSPI小鼠血清能够抑制幼虫侵入肠上皮细胞并介导ADCC杀伤NBL且rTsSPI对小鼠有一定的免疫保护作用。

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