RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究

目录

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英文缩略词表

1 前言

1.1 旋毛虫与旋毛虫病

1.2 RNA干扰技术

1.3 TsSP1.2的研究

1.4 TsSPI基因

1.5 研究意义

2. 材料

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 实验动物 、旋毛虫虫种及所用细胞

2.4 主要试剂的配制

2.4.1 LB液体培养基（200ml）

2.4.2 LB固体培养基（200ml）

2.4.4 核酸电泳缓冲液（50x，200ml）

2.4.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂

2.4.6 5×SDS-PAGE LoadingBuffer

2.4.7Western blot所需试剂

3. 方法

3.1 技术路线

3.2菌种的活化，蛋白诱导表达

3.3 蛋白的纯化

3.3.1 TsSP1.2蛋白的纯化

3.3.2 TsSPI蛋白的纯化

3.4 纯化蛋白的浓度测定

3.4.1 TsSP1.2 蛋白浓度测定

3.4.2 TsSPI蛋白浓度测定

3.5 ELASA法检测蛋白抗血清的效价

3.6 siRNA的设计和合成

3.6.1 siRNA的设计与合成

3.6.2 旋毛虫肌幼虫感染小鼠

3.6.3 旋毛虫肌幼虫的收集

3.6.4 将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内

3.7 虫体可溶的提取

3.8 Weastern blot

3.9 提取旋毛虫肌幼虫RNA

3.10 RNA 反转录样本cDNA

3.11 RT-PCR验证cDNA质量

3.12 Real-time PCR

3.15.1IECs的培养

3.15.2 不同浓度siRNA对旋毛虫幼虫侵入肠上皮细胞 IECs的影响

3.16RNAi对于旋毛虫肌幼虫侵入肠粘膜及其发育影响

3.16.1RNAi后观察对各期虫体数量及形态学变化

3.16.2 RNAi后旋毛虫各虫期形态变化及成生殖力的影响

3.17 数据处理

4 结果

4.1.1 siRNA的设计合成

4.1.2 将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内

4.1.3 qPCR验证siRNA对TsSP1.2基因转录水平的影响

4.1.4Western blotting通过蛋白水平检测RNAi对TsSP1.2表达量变化

4.1.5 TsSP1.2基因沉默后肌幼虫体外存活及侵入IECs情况

4.1.6 TsSP1.2基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响

4.1.7 siRNA-534处理后对各虫期虫体形态大小的影响

4.1.8 RNAi的基因特异性

4.2 应用RNAi对TsSPI蛋白的研究

4.2.1 siRNA的设计合成

4.2.2 siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内

4.2.3 qPCR验证siRNA对TsSPI基因转录水平的影响

4.2.4Western blotting验证siRNA对TsSPI蛋白水平的表达量变化

4.2.5 TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活及入侵IECs

4.2.6 TsSPI基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响

4.2.7 siRNA-653处理后对各虫期虫体形态大小的影响

5 讨论

5.1 RNAi技术的应用

5.2 RNAi在 TsSP1.2基因的应用

5.3 RNAi在TsSPI基因的应用

6. 结论

结语

参考文献

个人简历

致谢